ABSTRACT The aim of this study was to evaluate the effect of Insulin-Transferrin-Selenium (ITS) supplementation in embryo culture on the blastocyst rate and embryo quality. The bovine zygotes obtained by in vitro maturation (MIV) and fertilization (IVF) were transferred to Evolve medium in 4 groups (T1: Without ITS supplement; T2: ITS the first 48 h of culture (CIV1): T3: ITS after day 2 of culture (CIV2), T4: ITS during all culture time (CIV1+CIV2). All procedures were performed at 38.5 °C,5%CO2and90%relativehumidity. The cleavage and blastocyst rates were determined at 48 h and day 8 of culture. The total cell number and the production of reactive oxygen species (ROS) in the expanded blastocysts were determined by staining the nucleus with Hoechst and the oxidation of the fluorescent probe dichlorodihydrofluorescein diacetate (H2DCFDA). The T4 cultured embryos presented the highest rate of blastocysts (32.6%) and total cell number (145.6) compared to the control group without STI (26.2% and 98.6, respectively; p<0.05). Likewise, the production of ROS in T4 blastocysts was lower (p<0.05) than that obtained in the other study groups. The results show that the addition of the ITS supplement throughout the embryo culture time has beneficial effects on the percentage of blastocysts and embryo quality, assessed by the number of total cells and the production of ROS.

RESUMEN El estudio tuvo como objetivo evaluar el efecto del suplemento Insulina-Transferrina-Selenio (ITS) en el cultivo embrionario sobre la tasa de blastocistos y calidad embrionaria. Los cigotos de bovino obtenidos por maduración (MIV) y fertilización in vitro (FIV) fueron transferidos a medio Evolve en 4 grupos (T1: Sin suplemento ITS; T2: ITS las primeras 48 h de cultivo (CIV1): T3: ITS después del día 2 de cultivo (CIV2), T4: ITS todo el tiempo de cultivo (CIV1 + CIV2). Todos los procedimientos se realizaron a 38.5 °C, 5% de CO2 y 90% de humedad relativa. Las tasas de clivaje y de blastocistos se determinaron a las 48 h y día 8 de cultivo, respectivamente. El número de células totales y la producción de especies reactivas de oxígeno (EROs) en los blastocistos expandidos fueron determinados por tinción del núcleo con Hoechst y la oxidación de la sonda fluorescente diacetato diclorodihidrofluoresceína (H2DCFDA). Los embriones cultivados de T4 presentaron la mayor tasa de blastocistos (32.6%) y número de células totales (145.6) comparada al grupo control sin ITS (26.2% y 98.6, respectivamente; p<0.05). Asimismo, la producción de EROs en los blastocistos de T4 fue menor (p<0.05) que la obtenida en los demás grupos de estudio. Los resultados demuestran que la adición del suplemento ITS durante todo el tiempo de cultivo embrionario tiene efectos benéficos sobre el porcentaje de blastocistos y calidad embrionaria, valorada por el número de células totales y la producción de EROs.

ABSTRACT This experiment aimed to assess the effect of fetal calf serum (FCS) added to culture medium on day 5 to 7 after in vitro fertilization on production and subsequent cryotolerance of blastocysts from Ecuadorian Creole heifers. Immature cumulus-oocyte complexes (COCs) were collected by ovum pick-up (OPU) from 10 Creole heifers and from ovaries collected at abattoir in eight collection sessions. COCs were subjected to in vitro maturation (IVM), fertilization (IVF), and culture (IVC). On day 1 after IVF, presumptive embryos from each oocyte source (OPU [O] and Abattoir [A]) were allocated randomly in two groups according to whether 2.5% (v/v) FCS was added to culture medium on day 5 after IVF: 1) O-FCS+, 2) O-FCS-, 3) A-FCS+, and 4) A-FCS-. On day 7 after IVF, high quality embryos were vitrified. Cryotolerance of vitrified-warmed embryos was assessed according to blastocele re-expansion at 2 h and subsequent re-expansion and hatching at 24 and 48 h of re-incubation. Blastocysts rate on day 7 did not differ between oocyte source and FCS group. After vitrification/warming process, addition of FCS affected the re-expansion rate only at 2 h, irrespective of the oocyte source (p<0.05). Likewise, blastocysts hatching rate at 48 h of incubation was drastically affected only in OPU derived oocyte (p<0.01). Supplementation of FCS on day 5 after IVF did not improve blastocyst production and adversely affected the cryotolerance of in vitro bovine embryos derived from creole heifers raised on Ecuadorian Andean highlands.

RESUMEN El estudio tuvo como objetivo evaluar el efecto del suero fetal bovino (FCS) agregado al medio de cultivo los días 5 a 7 después de la fertilización in vitro sobre la producción y posterior criotolerancia de blastocistos de vaquillonas criollas ecuatorianas. Se recolectaron complejos cúmulo-ovocitos (COCs) inmaduros mediante aspiración intravaginal guiada por ultrasonido (OPU) de 10 vaquillonas criollas y de ovarios de matadero en ocho sesiones. Los COCs se sometieron a maduración in vitro (MIV), fecundación (FIV) y cultivo (IVC). El día 1 después de la FIV, los presuntos embriones de cada fuente de ovocitos (OPU [O] y Matadero [A]) se asignaron aleatoriamente en dos grupos según si se añadió FCS al 2.5% (v/v) al medio de cultivo el día 5 después de la FIV: 1) O-FCS+, 2) O-FCS-, 3) A-FCS+ y 4) A-FCS-. El día 7 después de la FIV se vitrificaron embriones de alta calidad. La criotolerancia de los embriones vitrificados-calentados se evaluó según la reexpansión del blastocele a las 2 h y la posterior reexpansión y eclosión a las 24 y 48 h de incubación. La tasa de blastocistos el día 7 no difirió entre la fuente de ovocitos y el grupo FCS. Después del proceso de vitrificación/ calentamiento, la adición de FCS solo afectó la tasa de reexpansión a las 2 h, independientemente de la fuente de ovocitos (p<0.05). Asimismo, la tasa de eclosión de los blastocistos a las 48 h de incubación se vio drásticamente afectada únicamente en los ovocitos derivados de OPU (p<0.01). En conclusión, la suplementación de FCS el día 5 después de la FIV no mejoró la producción de blastocistos y afectó negativamente la criotolerancia de embriones bovinos in vitro derivados de vaquillonas criollas criadas en los Andes ecuatorianos.

ABSTRACT: Piura is the region with the largest organic banana production in Peru; however, the post-harvest disease crown rot has generated large economic losses. Therefore, the following objectives were raised: to evaluate the efficacy of biofungicides in vitro and in vivo for the control of this disease. The products used were: oregano extract, citric acid; ascorbic acid, bioflavonoids; biofertilizer and tea tree oil. In vitro, the "poisoned medium" method was used. In vivo, fruits were inoculated with conidial suspensions at 1 x 104 CFU ml-1 of the phytopathogens Thielaviopsis paradoxa and Colletotrichum musae. The biofungicides were prepared according to the commercial dose. The products were applied, and the fungi were inoculated with manual sprayers. The banana clusters with treatment were placed in 18,4 kg cardboard boxes and packed, incubating at 13 °C for 18 days and 4 days in a maturation chamber with ethylene gas. In vitro, the biofungicides: oregano extract (1450 ppm) and citric acid (2825 ppm) obtained 100% inhibition in the growth of the mycelium of T. paradoxa and C. musae. In fruits, the lowest severity index was for the citrus extract biofungicide (4275 ppm), registering 0,0% against T. paradoxa and C. musae.

RESUMEN: Piura es la región con mayor producción de banano orgánico en el Perú; sin embargo, la enfermedad post cosecha de la pudrición de la corona ha generado grandes pérdidas económicas. Por lo cual, se planteó los siguientes objetivos: evaluar la eficacia de biofungicidas in vitro e in vivo para el control de esta enfermedad. Los productos usados fueron: extracto de orégano, ácido cítrico; ácido ascórbico, bioflavonoides; biofertilizante y aceite del árbol de té. In vitro se utilizó el método del “medio envenenado”. In vivo, se inocularon a frutos con suspensiones de conidias a 1 x 104 UFC mL-1 de los fitopatógenos Thielaviopsis paradoxa y Colletotrichum musae. Se prepararon los biofungicidas según la dosis comercial. Se aplicaron los productos y se inocularon los hongos con asperjadores manuales. Los clústeres de banano con tratamiento se embalaron en cajas de cartón de 18,4 kg y fueron embaladas incubándose a 13 °C durante 18 días y 4 días en cámara de maduración con gas etileno. En in vitro los biofungicidas: extracto de orégano (1450 ppm) y ácido cítrico (2825 ppm) obtuvieron 100% inhibición en el crecimiento del micelio de T. paradoxa y C. musae. En in vivo los frutos el menor índice de severidad lo fue para el biofungicida extracto de cítricos (4275 ppm) registrándose 0,0% frente a T. paradoxa y C. musae.

The aim of this study was to assess the effect of eugenol on the in vitro production of ovine embryos. Oocytes were aspirated and taken for in vitro maturation (IVM), where they were divided into 4 groups: the CON (control), in which the oocytes were immersed in medium without an antioxidant; in the EU10, EU20, EU40 groups, the same medium as in the COM group was used, supplemented with 10, 20, and 40 µM of eugenol, respectively. The degree of expansion of cumulus cells was evaluated. Subsequently, the oocytes underwent in vitro fertilization and in vitro culture, and at the end of this process, the rate of cleaved structures was assessed. Regarding the expansion rate of cumulus cells, the CON group exhibited higher rates compared to the groups supplemented with eugenol. Evaluating oocytes with fully expanded cumulus cells, only the EU40 group showed a lower rate when compared to the rest of the treatment groups. Whereas observing oocytes with partially expanded cumulus cells, the EU40 group showed higher expansion percentages compared to the other treatments. Concerning the presence of the first polar body in the oocytes, it was observed that there was no statistical difference between the treatment groups. Lastly, concerning the cleaved structures, the CON and EU10 groups showed the highest rates compared to the EU20 and EU40 groups. Thus, it was possible to conclude that the use of 10 µM of eugenol in the IVM of ovine oocytes proved to be the optimal concentration of this substance.

El objetivo del presente estudio fue evaluar el efecto del eugenol en la producción in vitro de embriones ovinos. Los ovocitos fueron aspirados y llevados para la maduración in vitro (MIV), donde se dividieron en 4 grupos: el CON (control), en el cual los ovocitos fueron sumergidos en medio sin antioxidantes; en los grupos EU10, EU20, EU40 se utilizó el mismo medio que en el grupo CON, pero con la adición de 10, 20 y 40 µM de eugenol, respectivamente. Se evaluó el grado de expansión de las células del cúmulo. Después de esto, los ovocitos fueron sometidos a la fecundación in vitro y al cultivo in vitro, y al final de este proceso se evaluó la tasa de estructuras clivadas. En cuanto a la tasa de expansión de las células del cúmulo, el grupo CON mostró tasas más altas en comparación con los grupos suplementados con eugenol. Al evaluar los ovocitos con células del cúmulo totalmente expandidas, solo el grupo EU40 mostró una tasa más baja en comparación con el resto de los grupos de tratamiento. Mientras que al observar los ovocitos con células del cúmulo parcialmente expandidas, el grupo EU40 mostró porcentajes de expansión más altos en comparación con los otros tratamientos. Respecto a la presencia del primer corpúsculo polar en los ovocitos, se observó que no hubo diferencia estadística entre los grupos de tratamiento. Por último, en relación con las estructuras clivadas, los grupos CON y EU10 mostraron las tasas más altas en comparación con los grupos EU20 y EU40. Por lo tanto, se pudo concluir que el uso de 10 µM de eugenol en la MIV de ovocitos ovinos resultó ser la concentración óptima de esta sustância.

Objetivando avaliar o efeito do eugenol na produção in vitro de embriões ovinos. Os oócitos, foram aspirados e levados para a maturação in vitro (MIV), onde foram divididos em 4 grupos: o CON (controle), no qual os oócitos foram imersos em meio, sem antioxidante, já nos grupos EU10, EU20, EU40 foi utilizado o mesmo meio do grupo CON, acrescido de 10, 20 e 40 µM de eugenol, respectivamente. Foi avaliado o grau de expansão das células do cumulus. Após isso, os oócitos seguiram para a fecundação in vitro e cultivo in vitro, sendo, ao final desse processo, avaliada a taxa de estruturas clivadas. Em relação à taxa de expansão das células do cumulus, o grupo CON apresentou maiores taxas, quando comparado aos grupos adicionados de eugenol. Avaliando os oócitos com células do cumulus totalmente expandidas, somente o grupo EU40, apresentou-se menor, quando comparado ao restante dos grupos de tratamento. Já observando os oócitos com células do cumulus parcialmente expandidas, o grupo EU40, apresentou maiores percentuais de expansão, quando comparado aos demais tratamentos. Sobre a presença do primeiro corpúsculo polar nos oócitos, observou-se que não houve diferença estatística entre os grupos de tratamentos. E, por último, em relação às estruturas clivadas, os grupos CON e EU10 apresentaram as maiores taxas, quando comparado aos grupos EU20 e EU40. Dessa maneira, foi possível concluir que a utilização de 10 µM de eugenol na MIV de oócitos ovinos apresentou ser a melhor concentração dessa substância.

The aim of this study was to evaluate the effect of quercetin on the in vitro maturation (IVM) of oocytes and the subsequent in vitro fertilization (IVF) of ovine embryos. For this purpose, oocytes were collected and divided into the following treatment groups: control group, containing CON medium (control); and groups Q2, Q4, and Q8, with control medium supplemented with 2, 4, and 8 µM of quercetin, respectively. After IVM, the degree of cumulus cells expansion, presence of the first polar body (PB), and the other part of the oocytes proceeded to in vitro fertilization (IVF), where oocytes were incubated with spermatozoa for a period of 20 hours. Subsequently, the presumptive zygotes underwent in vitro culture (IVC) for 48 hours, and at the end of the process, the rate of cleaved structures was evaluated. The results were expressed in percentage and compared using the Chi-square test, with a significant difference considered when P&lt;0.05. Evaluating the expansion of cumulus cells, the CON and Q2 groups showed the best expansion rates compared to the Q4 and Q8 groups. Regarding the presence of the 1st PB, it was observed that only the Q8 group exhibited lower rates compared to the control group. When evaluating the rate of cleaved structures, it was observed that the Q2 group showed a higher number compared to the Q8 group. Quercetin does not influence the maturation of ovine oocytes.

El objetivo del presente estudio fue evaluar el efecto de la quercetina en la maduración in vitro (MIV) de ovocitos y la posterior fertilización in vitro (FIV) de embriones ovinos. Para ello, se recolectaron y seleccionaron ovocitos divididos en los siguientes grupos de tratamiento: grupo control, que contenía medio CON (control); y los grupos Q2, Q4 y Q8, con medio control al que se le añadieron 2, 4 y 8 µM de quercetina, respectivamente. Tras la MIV se evaluó el grado de expansión de las células del cúmulo, la presencia del primer corpúsculo polar (CP) y la otra parte de los ovocitos se utilizó para la fecundación in vitro (FIV), donde los ovocitos fueron incubados con espermatozoides durante un período de 20 horas. Posteriormente, los presuntos cigotos pasaron a cultivo in vitro (CIV) durante 48 horas y, al final del proceso, se evaluó la tasa de estructuras clivadas. Los resultados se expresaron en porcentaje y se compararon utilizando la prueba de Chi-cuadrado, considerando una diferencia significativa cuando P&lt;0,05. Al evaluar la expansión de las células del cúmulo, los grupos CON y Q2 mostraron las mejores tasas de expansión en comparación con los grupos Q4 y Q8. En cuanto a la presencia del 1er CP, se observó que solo el grupo Q8 mostró tasas más bajas en comparación con el grupo control. Al evaluar la tasa de estructuras clivadas, se observó que el grupo Q2 mostró un número mayor en comparación con el grupo Q8. La quercetina no influye en la maduración de ovocitos ovinos.

O objetivo do presente estudo foi avaliar o efeito da quercetina na MIV de oócitos e na subsequente PIV de embriões ovinos. Para isso, foram colhidos e selecionados oócitos divididos nos seguintes grupos de tratamento: grupo controle, contendo meio CON (controle); e grupos Q2, Q4 e Q8, com meio controle, acrescido de 2, 4 e 8 µM de quercetina, respectivamente. Após a MIV foi avaliado o grau de expansão das células do cumulus, presença do primeiro corpúsculo polar (CP) e a outra parte dos oócitos seguiu para a fecundação in vitro (FIV), onde os oócitos foram incubados com os espermatozoides, por um período de 20 h. Em seguida, os presumíveis zigotos seguiram para o cultivo in vitro (CIV), por um período de 48 h e, ao final do processo, foi avaliada a taxa de estruturas clivadas. Os resultados foram expressos em porcentagem e comparados, usando o Teste do Qui-quadrado e foi considerada diferença significativa quando P&lt;0,05. Avaliando a expansão das células do cumulus, os grupos CON e Q2 apresentaram as melhores taxas de expansão, quando comparadas aos grupos Q4 e Q8. Quanto à presença do 1º CP, foi possível observar que somente o grupo Q8 apresentou taxas menores, quando comparado ao grupo controle. Já avaliando a taxa de estruturas clivadas, foi possível observar que o grupo Q2 apresentou maior número quando comparado ao grupo Q8. A quercetina não influencia na maturação de oócitos ovinos.

ABSTRACT In birds, the process of sperm maturation has not been fully described. The objective of this study was to determine in vitro parameters for the decapacitating effect of oviductal proteins on rooster spermatozoa. Aliquots with spermatozoon were incubated to in vitro induce metabolic states: capacitation, decapacitation, and the acrosomal reaction to again determined percentages of live spermatozoa, motility, and concentrations of Malondialdehyde, reduced Glutathione and Adenosine triphosphate. The percentages of motility and live sperm in fresh and capacitated semen were similar (P>0.05), but higher (P<0.05) than those determined in decapacitated semen and with acrosome reaction. The determination of nmol/ml of MDA in fresh semen (1.59) was higher (P<0.005) than in capacitated semen (1.05), with acrosomal reaction (1.07) and decapacitated semen (1.05). GSH nmol/ml were similar (P>0.05) in fresh (72.6) and capacitated (62.04) semen, similarly (P<0.05) between acrosome reaction (99.09) and decapacitated (86.07) semen. The highest concentration of ATP was in capacitated semen with 69.9 µmol/ml, with similar concentrations (P<0.05) in fresh, with acrosomal reaction, and decapacitated semen. The parameters, determined, demonstrated that the protein fraction of the utero-vaginal junction, in vitro, produces decapacitation and successfully maintains sperm viability.

RESUMEN En las aves, no se ha descrito totalmente el proceso de maduración espermática. El objetivo del estudio fue determinar parámetros in vitro, del efecto no capacitante de las proteínas oviductales, en espermatozoides de gallo. Alícuotas con espermatozoides, fueron incubadas in vitro para inducir estados metabólicos de capacitación, no capacitación y reacción acrosomal para determinar porcentajes de espermatozoides vivos, su movilidad y concentraciones de Malondialdehído, Glutation reducido y Adenosin tri fosfato, como parámetros del estado metabólico de los espermatozoides. Los resultados mostraron porcentajes de movilidad y espermatozoides vivos en semen fresco y capacitado similares (P>0.05), pero mayores (P<0.05) a los determinados en espermatozoides con reacción acrosomal. Los nmol/ml de MDA en semen fresco (1.59) fue mayor (P<0.5) que en semen capacitado (1.05), con reacción acrosomal (1.07) y en semen no capacitado (1.05). Los nmol/ml de GSG fueron similares (P>0.05) en semen fresco (72.6) y capacitado (62.04), y entre semen con reacción acrosomal (99.09) y no capacitado (86.07). La mayor concentración de ATP fue en semen capacitado con 69.9 µmol/ml, con concentraciones similares (P<0.05) en semen fresco, con reacción acrosomal y no capacitados. Los parámetros determinados, demostraron que la fracción proteica de la unión útero-vaginal, in vitro produce no capacitación y mantiene la viabilidad espermática.

The objective of this study was to evaluate the effect of α-lipoic acid on in vitro maturation and of l-arginine on in vitro fertilization of oocytes for in vitro production of sheep embryos. Thus, the ovaries were collected at a local slaughterhouse and the oocytes collected by the method of follicular aspiration with a vacuum pump were divided equally into five maturation groups: CON, without addition of antioxidant; CIS group, with cysteamine as an antioxidant source; and the groups ALA5, ALA10 and ALA20, containing concentrations of 5.0, 10.0 and 20.0 µM of ALA. After 24h of maturation, the oocytes were evaluated concerning occurrence and degrees of expansion of the cumulus cells. The oocytes of the best IVM group were destinated for in vitro fertilization (IVF). The selected and capacitated sperm were included in five groups: CON, without addition of capacitator agent; HEP group, with heparin as a capacitator source; and ARG5, ARG10 and ARG20 groups, where IVF occurred in the same HEP medium, replacing heparin with 5 mM, 10 mM and 20 mM L-arginine, respectively. The results were expressed as a percentage and the variables of cumulus cell expansion and number of cleaved structures were compared using the chi-square test in Epi Info software (Epi Info 7.2.5, Atlanta, GA, USA, 2021). Results were considered significant when P &lt; 0.05. Regarding the expansion of cumulus cells all groups showed 100% expansion, on the total expansion category of COCs it was observed that ALA5 and ALA20 groups did not present the same proportion of COCs with total expansion as CIS group. After in vitro fertilization (IVF), there were no statistical differences in relation to the cleaved structures between CON, HEP, ARG5 and ARG10 groups. However, it was also observed that the use of 20.0 mM of L-arginine reduced the percentage of cleaved structures when compared to the ARG10 group (P&lt;0.05).

El objetivo de este trabajo fue evaluar el efecto del ácido α-lipoico en la maduración in vitro y la l-arginina en la fecundación in vitro de ovocitos para la producción in vitro de embriones ovinos. Así, se recolectaron ovocitos de ovarios obtenidos de mataderos mediante el método de aspiración folicular con bomba de vacío, los cuales se dividieron en cinco grupos de maduración: CON, sin adición de antioxidante, grupo CIS, con cisteamina como fuente antioxidante y los grupos ALA5, ALA10 y ALA20, que contienen concentraciones de 5, 10 y 20 µM de ácido α-lipoico. Después de 24 h de maduración, se evaluó la aparición y el grado de expansión de las células del cúmulo en los ovocitos. Los ovocitos del mejor grupo MIV fueron destinados a fecundación in vitro (FIV), siendo por tanto incluidos en gotas con medio de fecundación in vitro, junto con los espermatozoides seleccionados y capacitados, resultando en los siguientes grupos: CON, sin adición de agente capacitador; grupo HEP, con heparina como fuente de condensadores; y los grupos ARG5, ARG10 y ARG20, donde se produjo la FIV en el mismo medio HEP, reemplazando la heparina por L-arginina 5, 10 y 20 mM, respectivamente. Los resultados se expresaron en porcentajes y las variables expansión celular del cúmulo y número de estructuras escindidas se compararon mediante la prueba chicuadrado del software Epi Info (Epi Info 7.2.5, Atlanta, GA, USA, 2021). Los resultados se consideraron significativos cuando P lt; 0,05. En cuanto a la expansión de las células del cúmulo, todos los grupos mostraron 100% de expansión. Evaluando los grados de expansión de las células del cúmulo, en la categoría de expansión total, se observó que los grupos ALA5 y ALA20 presentaron la misma proporción de CCO con expansión total que el grupo CIS (Plt;0.05), sin embargo se observa que hay una tendencia a la baja de las estructuras con plena expansión cuando se utilizan antioxidantes. En cuanto a las estructuras escindidas, fue posible identificar que no hubo diferencias estadísticas en relación a las estructuras escindidas, entre los grupos CON, HEP, ARG5 y ARG10. Sin embargo, también se observó que el uso de Larginina 20 mM redujo el porcentaje de estructuras escindidas en comparación con el grupo ARG10 (Plt;0.05).

O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito do ácido α-lipóico na maturação in vitro e da l-arginina na fertilização in vitro de oócitos para produção in vitro de embriões ovinos. Desta forma, foram realizadas colheitas de oócitos oriundos de ovários obtidos em abatedouro através do método de aspiração folicular com bomba de vácuo, que foram divididos em cinco grupos de maturação: CON, sem adição de antioxidante, grupo CIS, com cisteamina como fonte antioxidante e os grupos ALA5, ALA10 e ALA20, contendo as concentrações de 5, 10, e 20 µM de ácido α-lipóico. Após 24h de maturação, os oócitos foram avaliados quanto à ocorrência e grau de expansão das células do cumulus. Os oócitos do melhor grupo MIV foram destinados à fertilização in vitro (FIV), sendo, portanto, incluídos em gotas com meio de fertilização in vitro, juntamente com os espermatozoides selecionados e capacitados, resultando nos seguintes grupos: CON, sem adição de capacitador agente; grupo HEP, com heparina como fonte de capacitor; e grupos ARG5, ARG10 e ARG20, onde a FIV ocorreu no mesmo meio HEP, substituindo a heparina por L-arginina 5, 10 e 20 mM, respectivamente. Os resultados foram expressos em porcentagem e as variáveis de expansão das células do cumulus e número de estruturas clivadas foram comparadas por meio do teste qui-quadrado do software Epi Info (Epi Info 7.2.5, Atlanta, GA, EUA, 2021). Os resultados foram considerados significativos quando P lt; 0,05. Em relação à expansão das células do cumulus, todos os grupos apresentaram 100% de expansão. Avaliando os graus de expansão das células do cumulus, na categoria de expansão total observou-se que os grupos ALA5 e ALA20 apresentaram a mesma proporção de CCO com expansão total que o grupo CIS (Plt;0,05), porém se observa que há uma tendência de queda de estruturas com expansão total quando os antioxidantes foram utilizados. Em relação às estruturas clivadas, foi possível identificar que não houve diferenças estatísticas em relação às estruturas clivadas, entre os grupos CON, HEP, ARG5 e ARG10. Contudo, também foi observado que o uso de 20 mM de L-arginina reduziu o percentual de estruturas clivadas quando comparado ao grupo ARG10 (Plt;0,05).

The objective of this study was to evaluate the effect of including cilostazol in the in vitro maturation medium of oocytes on the in vitro production of sheep embryos. Oocytes were collected from ovaries obtained from a slaughterhouse by follicular aspiration with a vacuum pump. The oocytes were divided into four maturation groups: the CON group, where the cumulus-oocyte complexes were immersed in TCM-199 supplemented with 500 IU of penicillin, 0.5 mg of streptomycin, 1.25 µg of amphotericin, 0.2 mM of sodium pyruvate, 10% (v/v) fetal bovine serum (FBS), 10 ng/mL of epidermal growth factor (EGF), 10 µg/mL of FSH, 10 µg/mL of LH, 10 µg/mL of estradiol, and 100 µM of cysteamine; and in the CILO0.3, CILO1, and CILO10 groups, the oocytes were matured in the CON group medium without the addition of cysteamine and supplemented with concentrations of 0.3, 1, and 10 µM of cilostazol, respectively. After 24 hours, the oocytes were evaluated for the presence or absence of cumulus cells and the degree of expansion and then subjected to in vitro fertilization (IVF) with sperm in FIV medium. After IVF, the presumptive zygotes were cultured in vitro. Cleavage was evaluated on day 2, with day 0 being the start of IVF. Results were expressed as a percentage, and variables such as cumulus cell expansion and the number of cleaved structures were compared using the chi-square test in the Epi Info software (Epi Info 7.2.5, Atlanta, GA, USA, 2021). Results were considered significant when P lt; 0.05. All groups showed 100% cumulus cell expansion, and there were no significant differences in cumulus cell expansion degree between the cilostazol- and cysteamine-supplemented groups (P gt; 0.05), as well as no significant differences in cleavage rates between the cilostazol- and cysteamine-supplemented groups (P gt; 0.05).

El objetivo de este estudio fue evaluar el efecto de la inclusión de cilostazol en el medio de maduración in vitro de ovocitos sobre la producción in vitro de embriones ovinos. Para ello, se realizaron recolecciones de ovocitos provenientes de ovarios obtenidos en un matadero mediante el método de aspiración folicular con bomba de vacío. Los ovocitos se dividieron en cuatro grupos de maduración: grupo CON, donde los complejos cúmulus ovocitos se sumergieron en TCM-199, suplementado con 500 UI de penicilina, 0,5 mg de estreptomicina, 1,25 µg de anfotericina, 0,2 mM de piruvato de sodio, 10% (v/v) de suero fetal bovino (SFB), 10 ng/mL de factor de crecimiento epidérmico (EGF), 10 µg/m de FSH, 10 µg/mL de LH, 10 µg/mL de estradiol y 100 µM de cisteamina; y en los grupos CILO0,3; CILO1 y CILO10, los ovocitos se maduraron en el medio del grupo CON, pero sin la adición de cisteamina y suplementado con las concentraciones de 0,3; 1 y 10 µM, respectivamente. Después de 24 horas, los ovocitos se evaluaron en cuanto a la presencia o no de células del cúmulus y en cuanto al grado de expansión y se destinaron a la fecundación in vitro, en medio FIV, junto con espermatozoides. Después de la FIV, los presuntos cigotos siguieron para el cultivo in vitro. Se evaluaron las clivajes en el día 2, siendo el día 0 el día del inicio del CIV. Los resultados se expresaron en porcentaje y las variables de expansión de las células del cúmulus y número de estructuras clivadas se compararon mediante la prueba del chi-cuadrado del software Epi Info (Epi Info 7.2.5, Atlanta, GA, EE. UU., 2021). Los resultados se consideraron significativos cuando P lt; 0,05. En relación a la expansión de las células del cúmulus, todos los grupos presentaron el 100% de expansión. No hubo diferencias significativas en cuanto al grado de expansión de las células del cúmulus entre los grupos suplementados con cilostazol y cisteamina (P gt; 0,05), así como no hubo diferencias significativas entre las tasas de clivaje entre los grupos suplementados con cilostazol y cisteamina (P gt; 0,05).

O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito da inclusão de cilostazol no meio de maturação in vitro de oócitos sobre produção in vitro de embriões ovinos. Para isso, foram realizadas colheitas de oócitos oriundos de ovários obtidos em abatedouro por meio do método de aspiração folicular com bomba de vácuo. Os oócitos foram divididos em quatro grupos de maturação: grupo CON, onde os complexos cumulus oócitos foram imersos em TCM-199, suplementado com 500 UI de penicilina, 0,5 mg de estreptomicina, 1,25 µg de anfotericina, 0,2 mM de piruvato de sódio, 10% (v/v) de soro fetal bovino (SFB), 10 ng/mL de fator de crescimento epidérmico (EGF), 10 µg/m de FSH, 10 µg/mL de LH, 10 µg/mL de estradiol e 100 µM de cisteamina; e nos grupos CILO0,3; CILO1 e CILO10, os oócitos foram maturados no meio do grupo CON, mas sem a adição de cisteamina e suplementado com as concentrações de de 0,3; 1 e 10 µM , respectivamente. Após 24h, os oócitos foram avaliados quanto a presença ou não de células do cumulus e quanto ao grau de expansão e destinados à fecundação in vitro, em meio FIV, juntamente com espermatozoides. Após a FIV, os presumíveis zigotos seguiram para o cultivo in vitro. Foram avaliadas clivagens no dia 2, sendo dia 0 o dia do início do CIV. Os resultados foram expressos em porcentagem e as variáveis de expansão das células do cumulus e número de estruturas clivadas foram comparadas por meio do teste qui-quadrado do software Epi Info (Epi Info 7.2.5, Atlanta, GA, EUA, 2021). Os resultados foram considerados significativos quando P lt; 0,05. Em relação à expansão das células do cumulus, todos os grupos apresentaram 100% de expansão. Não houve diferenças significativas quanto ao grau de expansão das células do cumulus entre os grupos suplementados com cilostazol e cisteamina (P gt; 0,05), assim como não houve diferenças significativas entre as taxas de clivagem entre os grupos suplementados com cilostazol e cisteamina (P gt; 0,05).

Resumen Introducción: la osteoporosis es la enfermedad ósea más prevalente y una de las principales causas de discapacidad crónica en las edades medias y avanzadas. Los tratamientos farmacológicos convencionales aún son limitados y su uso prolongado puede provocar efectos adversos que motiven baja adherencia al tratamiento. Las estrategias nutricionales se basan tradicionalmente en suplementar la dieta con calcio y vitamina D. Estudios recientes confirman que los resultados de esta suplementación mejoran significativamente si se acompaña de la ingesta de colágeno hidrolizado oral. Objetivo: evaluar la posible actividad osteogénica in vitro de un complejo péptido-mineral formado por colágeno hidrolizado e hidroxiapatita bovinos (Phoscollagen®, PHC®). Métodos: se simuló la digestión y absorción de PHC® utilizando el digestor dinámico gastrointestinal de AINIA y el modelo celular Caco-2, respectivamente. Cultivos primarios de osteoblastos humanos se trataron con la fracción resultante de PHC® y se evaluaron los cambios en la proliferación de los preosteoblastos y en la expresión del ARNm de los biomarcadores osteogénicos en diferentes etapas de maduración de los osteoblastos: factor de transcripción 2 relacionado con Runt (Runx2), fosfatasa alcalina (ALP), osteocalcina (OC) y colágeno tipo I (ColA1). Resultados: se observó un incremento de la proliferación preosteoblástica (p ≤ 0,05). No se detectaron cambios en los biomarcadores de osteoblastos con 5 días de diferenciación, pero sí con 14 días, registrándose un aumento de Runx2 (p = 0,0008), ColA1 (p = 0,035), OC (p = 0,027) y ALP (sin significancia). Conclusión: estos resultados muestran que el complejo péptido-mineral PHC® estimula la actividad de osteoblastos maduros, siendo susceptible de promover la formación ósea.

Abstract Introduction: osteoporosis is the most prevalent bone disease and one of the main causes of chronic disability in middle and advanced ages. Conventional pharmacological treatments are still limited, and their prolonged use can cause adverse effects that motivate poor adherence to treatment. Nutritional strategies are traditionally based on supplementing the diet with calcium and vitamin D. Recent studies confirm that the results of this supplementation are significantly improved if it is accompanied by the intake of oral hydrolyzed collagen. Objective: to evaluate the possible in vitro osteogenic activity of a peptide-mineral complex formed by bovine hydrolyzed collagen and bovine hydroxyapatite (Phoscollagen®, PHC®). Methods: the digestion and absorption of PHC® were simulated using the dynamic gastrointestinal digester of AINIA and Caco-2 cell model, respectively. Primary cultures of human osteoblasts were treated with the resulting fraction of PHC® and changes were evaluated in the proliferation of preosteoblasts and in the mRNA expression of osteogenic biomarkers at different stages of osteoblast maturation: Runt-related transcription factor 2 (Runx2), alkaline phosphatase (ALP), osteocalcin (OC) and type I collagen (ColA1). Results: an increase in preosteoblastic proliferation was observed (p ≤ 0,05). No changes were detected in the biomarkers of osteoblasts with 5 days of differentiation, but with 14 days, registering in this case an increase in Runx2 (p = 0.0008), ColA1 (p = 0.035), OC (p = 0.027) and ALP (without significance). Conclusion: these results show that PHC® peptide-mineral complex stimulates the activity of mature osteoblasts, being capable of promoting bone formation.

ABSTRACT In vitro embryo production (IVP) is a biotechnology applied to different species of domestic and wild mammals, in addition to humans. IVP includes the in vitro maturation of oocytes (IVM), in vitro fertilization of matured oocytes (IVF) and the in vitro culture of fertilized oocytes (IVC). In the IVM and IVC processes there is an increase in levels of reactive oxygen species (ROS) that generate higher levels of oxidative stress, which together with a deficient antioxidant system in in vitro conditions can affect these processes. Faced with this situation, the maturation media are supplemented with antioxidant compounds such as cysteamine (CYS), which is an amino thiol (SCH2CH2NH) of low molecular weight (77.1 g/mol), has its own antioxidant activity, promotes the transport of cysteine to the interior of the cell and favours the synthesis of glutathione (GSH). Research on the use of CYS in IVP indicates that it stimulates GSH production, oocyte maturation and favours the segmentation and blastulation process. In addition, it has synergistic effects with other antioxidants or with growth factors, so the interest in this molecule and its effects on IVP has increased over the years. This review article presents the properties and effects of cysteamine in the in vitro production system of embryos in ruminants.

RESUMEN La producción in vitro de embriones (PIVE) es una biotecnología aplicada a diferentes especies de mamíferos domésticos y silvestres, además del humano. La PIVE comprende la maduración in vitro de ovocitos (MIV), fecundación in vitro de ovocitos madurados (FIV) y el cultivo in vitro de ovocitos fertilizados (CIV). En los procesos de la MIV y CIV se tiene un incremento de los niveles de especies reactivas del oxígeno (ROS) que generan mayores niveles de estrés oxidativo, que ante junto a un deficiente sistema antioxidante en condiciones in vitro se pueden afectar estos procesos. Ante esta situación, los medios de maduración se suplementan con compuestos antioxidantes como la cisteamina (CYS) que es un amino tiol (HSCH2CH2NH) de bajo peso molecular (77.1 g/mol), tiene actividad antioxidante propia, promueve el transporte de cisteína al interior de la célula y favorece la síntesis de glutatión (GSH). Investigaciones sobre el uso de la CYS en la PIVE indican que se estimula la producción de GSH, la maduración ovocitaria y favorece el proceso de segmentación y blastulación; asimismo, tiene efectos sinérgicos con otros antioxidantes o con factores de crecimiento, de manera que el interés sobre esta molécula y sus efectos en la PIVE ha ido aumentando a través de los años. Este artículo de revisión presenta las propiedades y efectos de la cisteamina en el sistema de producción in vitro de embriones en rumiantes.

RESUMEN El objetivo del estudio fue evaluar el efecto del YM976 como inhibidor específico de la fosfodiesterasa tipo 4 (PDE-4) sobre la maduración in vitro de oocitos bovinos y su capacidad de desarrollo embrionario. Para ello, complejos cúmulo-oocito se obtuvieron por aspiración folicular de ovarios obtenidos en planta de sacrificio. Se maduraron in vitro por 24 horas en medio TCM-199 suplementado con cuatro concentraciones de YM976 (1, 10, 100 y 1000 nM) o con gonadotropinas (LH y FSH). Se evaluó la expansión del cúmulo por observación visual y la reanudación de la metafase II por tinción con colorante Hoechst. Los oocitos fueron fertilizados y cultivados en medio KSOM Evolve por ocho días. El porcentaje de expansión grado 3 de las células de cúmulo en oocitos cultivados con gonadotropinas fue diferente (p= 0.00016) respecto de los cultivado en presencia del YM976. La reanudación de la metafase II fue similar entre oocitos madura- dos a 10 nM de YM976 y los madurados con gonadotropinas. Los oocitos madurados en concentraciones de 1 y 10 nM de YM976 presentaron un desarrollo embrionario temprano similar al encontrado en los madurados con gonadotropinas. Por el contrario, altas concentraciones de YM976 tuvieron efectos deletéreos. En conclusión, concentraciones 1 y 10 nM del inhibidor de PDE-4 YM976 durante la maduración in vitro de oocitos retrasa la expansión de las células de la granulosa, pero permite una maduración nuclear y competencia para el desarrollo embrionario, similar a los oocitos madurados con gonadotropinas, sugiriendo que, el uso de YM976 puede ser aplicado en procesos de maduración in vitro de oocitos bovinos.

ABSTRACT The aim of this study was to evaluate the effect of YM976 as a specific inhibitor of phosphodiesterase type 4 (PDE-4) on the in vitro maturation of bovine oocytes and their capacity for embryonic development. For this, cumulus-oocyte complexes were obtained by follicular aspiration of ovaries obtained in a slaughterhouse. They were matured in vitro for 24 hours in TCM-199 medium supplemented with four concentrations of YM976 (1, 10, 100 and 1000 nM) or with gonadotropins (LH and FSH). The expansion of the cumulus was evaluated by visual observation and the resumption of metaphase II by staining with Hoechst dye. The oocytes were fertilized and cultured in KSOM Evolve medium for eight days. The percentage of grade 3 expansion of the cumulus cells in oocytes cultured with gonadotropins was different (p=0.00016) compared to those cultured in the presence of YM976. The resumption of metaphase II was similar between oocytes matured at 10 nM YM976 and those matured with gonadotropins. The oocytes matured in concentrations of 1 and 10 nM of YM976 presented an early embryonic development similar to that found in those matured with gonadotropins. In contrast, high concentrations of YM976 had deleterious effects. In conclusion, concentrations of 1 and 10 nM of the PDE-4 inhibitor YM976 during in vitro maturation of oocytes delay the expansion of granulosa cells, but allow nuclear maturation and competition for embryonic development, similar to oocytes matured with gonadotropins, suggesting that the use of YM976 can be applied in in vitro maturation processes of bovine oocytes.

RESUMEN La variedad de café Colombia (Coffea arabica L.) tiene alta resistencia a la roya y buenas características de producción y calidad de taza. Diversos protocolos para la propagación de café mediante embriogénesis somática han sido desarrollados; sin embargo, la tasa de maduración, germinación y conversión es baja. El objetivo de la presente investigación fue determinar el efecto de reguladores del crecimiento y agentes osmóticos en la maduración y germinación de embriones somáticos de café y evaluar, en condiciones ex vitro, las características fisiológicas de las plantas regeneradas. Para su maduración, embriones globulares y torpedo temprano se cultivaron en un medio Yasuda et al. (1985) con distintas concentraciones de ácido abscísico (ABA) (2-4 mg L-1), ácido salicílico (ASA) (1.38 g L-1), ácido giberélico (AG3) (0.7-1.0 mg L-1), ácido indolacético (AIA) (0.3-0.5 mg L-1), polietilenglicol 8000 (PEG 8000) (50-75 g L-1) o sacarosa (50-80 g L-1). Para su germinación, los embriones maduros fueron transferidos a un medio con 0.25 mg L-1 de AIA y 0.25 mg L-1 de 6-bencilaminopurina (BAP). Las plantas se aclimataron y crecieron en perlita:turba:tezontle (1:1:1) o turba:tezontle (2:1) en condiciones de invernadero. El valor máximo de maduración y germinación de los embriones globulares se observó al adicionar 50 g L-1 de sacarosa al medio (81.7 y 53.9 % respectivamente). Para los embriones torpedo temprano el porcentaje de maduración más alto se registró con 80 g L-1 de sacarosa (19.2 %) o una combinación de 1.0 mg L-1 de AG3 y 0.5 mg L-1 de AIA (45.0 %); sin embargo, los porcentajes de germinación no fueron significativamente distintos del testigo. El potencial osmótico de los embriones no estuvo directamente relacionado con su grado de madurez. La totalidad de las plantas cultivadas en las mezclas de sustratos sobrevivieron y mostraron ser morfológica y fisiológicamente normales bajo condiciones ex vitro.

SUMMARY The Colombia coffee variety (Coffea arabica L.) has high resistance to rust and good production characteristics and cup quality. Several protocols have been developed for the propagation of coffee by somatic embryogenesis; however, the rate of maturation, germination and conversion is low. The objective of this study was to determine the effect of growth regulators and osmotic agents on the maturation and germination of coffee somatic embryos and to evaluate, under ex vitro conditions, the physiological characteristics of the regenerated plants. For maturation, globular and early torpedo embryos were cultured on a Yasuda et al. (1985) medium with different concentrations of abscisic acid (ABA) (2-4 mg L-1), salicylic acid (SA) (1.38 g L-1), gibberellic acid (AG3) (0.7-1.0 mg L-1), indoleacetic acid (AIA) (0.3-0.5 mg L-1), polyethylene glycol 8000 (PEG 8000) (50-75 g L-1) or sucrose (50-80 g L-1). For germination, the mature embryos were transferred into a medium with 0.25 mg L-1 of IAA and 0.25 mg L-1 of 6-benzylaminopurine (BAP). The plants were acclimatized and grown on perlite:peat:volcanic rock (1:1:1) or peat:volcanic rock (2:1) under greenhouse conditions. The maximum value of maturation and germination of globular embryos was observed when 50 g L-1 of sucrose were added to the medium (81.7 y 53.9 % respectively). For early torpedo embryos, the highest percentage of maturation was recorded with 80 g L-1 of sucrose (19.2 %) or a combination of 1.0 mg L-1 GA3 and 0.5 mg L-1 of IAA (45.0 %):however, the germination percentages were not significantly different from the control. The osmotic potential of the embryos was not directly related to their degree of matu-rity. All the plants grown on the substrate mixtures survived and were morphologically and physiologically normal under ex vitro conditions.

ABSTRACT Introduction: Vaccine strategies to enhance CTLs response are still a challenge since it is necessary to favor the exogenous antigens (Ag) cross-presentation by antigen presenting cells (APCs). For this purpose, liposomes encapsulating bacteria pore-forming proteins (PFPs) have been used. Objective. To explore the ability of liposomes co-encapsulating the Ag ovalbumin (OVA) and sticholysin II (StII), a PFP produced by Stichodactyla helianthus, to induce a CTL response, functional in a tumor model. Methods: Liposomes co-encapsulating OVA and StII were prepared by dehydration-rehydration (Lp/OVA/StII). The response of CTLs was evaluated, as well as the antitumor activity in a preventive setting. The ability of StII to stimulate maturation of dendritic cells (DCs) in vitro was also explored. Results: Lp/OVA/StII enhanced the OVA-specific CTL response and antitumor activity in mice challenged with the E.G7-OVA tumor. StII induced the maturation of DCs in vitro, which was dependent on the Toll-like receptor 4 (TLR4), with a contribution to the response of CTLs induced by the liposomal formulation in vivo. Lp/OVA/StII favored in vitro the cross-presentation of OVA and the activation of CD8+ T cells by macrophages, but not by DCs. These results are the first evidence that StII encapsulated into liposomes functions as a vaccine platform to induce a robust CTL response, with a contribution that goes beyond its ability to form pores in membranes.

RESUMEN Introducción: Las estrategias vacunales para potenciar respuestas de linfocitos T CD8+ citotóxicos (CTL) constituyen un reto debido a la necesidad de favorecer la presentación cruzada de antígenos (Ag) exógenos por las células presentadoras de antígenos (APC). Con este propósito se han empleado liposomas que encapsulan proteínas formadoras de poros (PFP) de origen bacteriano. Objetivo: explorar la habilidad de liposomas que co-encapsulan el Ag ovoalbúmina (OVA) y sticholysina II (StII), una PFP producida por Stichodactyla helianthus, de inducir una respuesta de CTL, funcional en un modelo tumoral. Métodos: Liposomas que co-encapsulaban OVA y StII se prepararon mediante deshidratación-rehidratación (Lp/OVA/StII). Se evaluó la respuesta de CTL, así como la actividad antitumoral en un escenario preventivo. La capacidad de StII de estimular la maduración de las células dendríticas (DC) in vitro fue también explorada. Resultados: Lp/OVA/StII potenció la respuesta de CTL específica a OVA y una actividad antitumoral en ratones retados con el tumor E. G7-OVA. StII indujo la maduración de las DC in vitro, lo que resultó dependiente del receptor tipo Toll 4 (TLR4), con una contribución en la respuesta de CTL inducida por la formulación liposomal in vivo. Lp/OVA/StII favoreció in vitro la presentación cruzada de OVA y la activación de células T CD8+ por macrófagos, pero no por DC. Estos resultados son la primera evidencia de que StII encapsulada en liposomas funciona como una plataforma vacunal para inducir una respuesta de CTL robusta, con una contribución que va más allá de su habilidad de formar poros en membranas.

Abstract Introduction: Biomechanical stimulation of cultured human osteoblast-like cells, which is based on controlled mechanical vibration, has been previously indicated, but the exact mechanical parameters that are effective for cells' proliferation enhancement are still elusive due to the lack of direct data recordings from the stimulated cells in culture. Therefore, we developed a low friction tunable system that enables recording of a narrow range of mechanical parameters, above the infrasonic spectrum, that applied uniformly to human osteoblast-like cells in monolayer culture, aiming to identify a range of mechanical parameters that are effective to enhance osteoblast proliferation in vitro. Methods: Human osteoblast-like cells in explant monolayer culture samples were exposed to mechanical vibration in the 10-70Hz range of frequencies for two minutes, in four 24 hours intervals. Cell numbers in culture, cellular alkaline phosphatase activity (a marker of cell maturation), and lactate dehydrogenase activity in culture media (representing cell death) were measured after the mechanical stimulation protocol application and compared statistically to the control cell cultures kept in static conditions. The cell proliferation was deduced from cell number in culture and cell death measurements. Results: We found that 50-70 Hz of vibration frequency protocol (10-30 µm of maximal displacement amplitude, 0.03g of peak-to-peak acceleration) is optimal for enhancing cells' proliferation (p<0.05), with a parallel decrease of their maturation (p<0.01). Discussion: We detected the optimal mechanical parameters of excitation protocol for induction of osteoblast proliferation in vitro by a mechanical platform, which can be used as a standardized method in the research of mechanotransduction in human osteoblast.

Resumen Introducción: La estimulación biomecánica de células similares a osteoblastos humanos cultivadas, que se basa en vibraciones mecánicas controladas se ha demostrado anteriormente, pero los parámetros mecánicos exactos que son efectivos para la mejora de la proliferación de células aún son difíciles de alcanzar debido a la falta de registros de datos directos de las células estimuladas en cultivo. Por lo tanto, desarrollamos un sistema sintonizable de baja fricción que permite el registro de un rango estrecho de parámetros mecánicos, por encima del espectro infrasónico, que se aplica de manera uniforme a células similares a osteoblastos humanos en cultivo monocapa, con el objetivo de identificar un rango de parámetros mecánicos que son efectivos para mejorar la proliferación de osteoblastos in vitro. Métodos: Se expusieron células similares a osteoblastos humanos en muestras de cultivo de monocapa de explante a vibración mecánica en el rango de frecuencias de 10-70 Hz durante dos minutos, en cuatro intervalos de 24 horas. El número de células en cultivo, la actividad de la fosfatasa alcalina celular (un marcador de maduración celular) y la actividad de la lactato deshidrogenasa en los medios de cultivo (que representa la muerte celular) se midieron después de la aplicación del protocolo de estimulación mecánica y se compararon estadísticamente con los cultivos de células de control mantenidos en condiciones estáticas. La proliferación celular se dedujo del número de células en cultivo y mediciones de muerte celular. Resultados: Encontramos que 50-70 Hz de protocolo de frecuencia de vibración (10-30 µm de amplitud de desplazamiento máxima, 0,03 g de aceleración de pico a pico) es óptimo para mejorar la proliferación de células (p <0,05), con una disminución paralela de su maduración (p <0.01). Discusión: Detectamos los parámetros mecánicos óptimos del protocolo de excitación para la inducción de la proliferación de osteoblastos in vitro mediante una plataforma mecánica, que puede utilizarse como método estandarizado en la investigación de la transducción mecánica en osteoblastos humanos.

Resumen Antecedentes: La calidad y maduración de los ovocitos son influenciados por la suplementación proteica. Objetivo: Evaluar la influencia de concentraciones de suero fetal bovino (FBS) y albúmina sérica bovina (BSA) en la recuperación y maduración in vitro (IVM) de ovocitos bovinos. Métodos: El estudio se dividió en Etapa 1 (recuperación de ovocitos) y Etapa 2 (IVM). En la primera etapa, tres experimentos se realizaron de acuerdo con el medio de recuperación: (R1) 10 vs. 20% FBS; (R2) 5 vs. 10% BSA; y (R3) los mejores resultados de R1, R2 y la combinación de FBS+BSA (5+5%). En la segunda etapa, el medio de maduración fue suplementado para tres experimentos: (M1) 5 vs. 10% FBS; (M2) 0,4 vs. 0,8% BSA; y (M3) mejores resultados de M1, M2 y la combinación de FBS+BSA (5+0,8%). Resultados: En la Etapa 1 (R1 y R2), los medios con 10% FBS y 10% BSA mostraron mejores resultados de calidad oocitaria y fueron definidos para el experimento R3. En R3, 10% FBS y la combinación de FBS+BSA (5+5%) permitieron la recuperación de ovocitos de mejor calidad. En la Etapa 2 (M1 y M2), los medios con ambos niveles de FBS (5 y 10%) y 0,8% de BSA se definieron como mejores de acuerdo con las tasas de maduración y viabilidad de las células del cumulus, por lo que se definieron para el experimento M3. En M3, no se observó diferencia entre los suplementos. Conclusiones: Para la recuperación de ovocitos, se puede utilizar 10% de FBS y la combinación de FBS+BSA (5+5%) para obtener ovocitos inmaduros. Para la maduración in vitro, FBS (ambos niveles, 5 y 10%) y BSA (0,8%) se pueden usar solos o en combinación.

Abstract Background: Oocyte quality and maturation are influenced by protein supplementation. Objective: To evaluate the influence of fetal bovine serum (FBS) and bovine serum albumin (BSA) concentrations on the recovery and in vitro maturation (IVM) of bovine oocytes. Methods: The study was divided into Stage 1 (oocyte recovery), and Stage 2 (IVM). In the first stage, three experiments were conducted according to the recovery (R) medium used: (R1) 10 vs. 20% FBS; (R2) 5 vs. 10% BSA; and (R3) the best results from R1, R2, and the combination of FBS+BSA (5+5%). Within the second stage, the maturation medium was supplemented according to three experiments: (M1) 5 vs. 10% FBS; (M2) 0.4 vs. 0.8% BSA; and (M3) better results of M1, M2, and the combination of FBS+BSA (5+0.8%). Results: In Stage 1 (R1 and R2), the media with 10% FBS and 10% BSA showed better oocyte quality results and were defined for experiment R3. In R3, the 10% FBS and the combination of FBS+BSA (5+5%) allowed recovery of better-quality oocytes. In Stage 2 (M1 and M2), media with both levels of FBS (5 and 10%) and 0.8% BSA were defined as better according to the maturation and viability rates of cumulus cells, so they were defined for experiment M3. In M3, no difference was noted among the supplements. Conclusions: For oocyte recovery, 10% FBS and the combination of FBS+BSA (5+5%) can be used to obtain immature oocytes. For the in vitro maturation, FBS (both levels, 5 and 10%) and BSA (0.8%) can be used alone or in combination.

Resumo Antecedentes: A qualidade e a maturação de oócitos são influenciadas pela suplementação proteica. Objetivo: Avaliar a influência de concentrações de soro fetal bovino (FBS) e albumina sérica bovina (BSA) sobre a recuperação e maturação in vitro (IVM) de oócitos bovinos. Métodos: O estudo foi dividido em Etapa 1 (recuperação de oócitos) e Etapa 2 (IVM). Na primeira etapa, três experimentos foram realizados de acordo com o meio de recuperação: (R1) 10 vs. 20% FBS; (R2) 5 vs. 10% BSA; e (R3) melhores resultados de R1, R2 e a combinação de FBS+BSA (5+5%). Na segunda etapa, o meio de maturação foi suplementado de acordo com três experimentos: (M1) 5 vs. 10% FBS; (M2) 0,4 vs. 0,8% BSA; e (M3) melhores resultados de M1, M2 e a combinação de FBS+BSA (5+0,8%). Resultados: Na Etapa 1 (R1 e R2), os meios com 10% FBS e 10% BSA mostraram melhores resultados de qualidade oocitária e foram definidos para o experimento R3. Em R3, 10% FBS e a combinação de FBS+BSA (5+5%) permitiram a recuperação de oócitos de melhor qualidade. Na segunda etapa (M1 e M2), meios com ambos os níveis de FBS (5 e 10%) e 0,8% BSA foram definidos como os melhores de acordo com as taxas de maturação e viabilidade de células do cumulus, então foram definidos para o experimento M3. No M3, não houve diferença entre os suplementos. Conclusões: Para a recuperação oocitária, 10% FBS e a combinação de FBS+BSA (5+5%) podem ser usados para obter oócitos imaturos. Para maturação in vitro, FBS (ambos os níveis, 5 e 10%) e BSA (0,8%) podem ser usados sozinhos ou em combinação.