ABSTRACT Antimicrobial peptides are small molecules that exhibit strong antagonistic activity against pathogenic microorganisms and are synthesized by a wide variety or organisms, including probiotic bacteria. The aim of the study was to identify peptides with antimicrobial activity in the Enterococcus faecium IP5-2a strain previously isolated from the intestinal tract of Nile tilapia (Oreochromis niloticus). Cellular and extracelullar proteins extraction was performed, followed by 1D SDS-PAGE gel electrophoresis and MALDI-TOF/TOF mass spectrometry. The results revealed peptides with antimicrobial activity, including P54 (SagA) protein, a bacteriocin-like protein and a lantibiotic. These proteins play an important role in the antagonistic capacity of the E. faecium IP52a strain, allowing it to be considered as a potential probiotic in the aquaculture industry.

RESUMEN Los péptidos antimicrobianos son moléculas pequeñas que poseen una fuerte actividad antagónica frente a microorganismo patógenos y son sintetizados por una amplia variedad de organismos, entre ellos, bacterias probióticas. El objetivo del estudio fue identificar péptidos con actividad antimicrobiana en la cepa Enterococcus faecium IP52a previamente aislada del tracto intestinal de tilapia del Nilo. Se realizó extracción de proteínas celulares y extracelulares, electroforesis en gel SDS-PAGE 1D y espectrometría de masas MALDI-TOF/TOF. Los resultados mostraron péptidos con actividad antimicrobiana, entre ellos la proteína P54 (SagA), una proteína similar a bacteriocina y un lantibiótico. Estas proteínas juegan un rol importante en la capacidad antagónica de la cepa E. faecium IP52a, permitiendo considerarla como un potencial probiótico en la industria acuícola.

The characteristics of a strain of Bacillus amyloliquefaciens isolated from the intestine of Arapaima gigas, selected for its ability to generate inhibition of multiple pathogenic bacteria of fishes were analyzed by using molecular tools such as PCR and mass spectrometry MALDI TOF / TOFM. The results showed through PCR that this strain has key genes for the generation of antimicrobial peptides such as bmyB (bacillomycin L synthetase B), fenD (fengycin synthetase), srfAA (subunit 1 surfactin synthetase), bacA (bacilysin biosynthesis protein) and iturin (iturin A). In addition, by mass spectrometry analysis were detected bacteriocins (plipastatin, gramicidin, fengycin, surfactin), intestine binding proteins (like-enolase), antimicrobial peptide transport proteins (ABC-transporters) and immune system stimulation proteins like flagelin. Collagenase, chitinases and xylose-isomerases proteins were also detected that contribute to the digestion and assimilation process. All these results allow to consider the multiple benefits of this strain to be used as a probiotic in fish culture.

Se analizaron las características de una cepa de Bacillus amyloliquefaciens aislada del intestino de Arapaima gigas, seleccionada por su capacidad para generar inhibición de múltiples bacterias patógenas de peces, mediante el uso de herramientas moleculares como PCR y espectrometría de masas MALDI TOF/TOF. Los resultados mostraron a través de PCR que esta cepa cuenta con genes claves para la generación de péptidos antimicrobianos como bmyB (bacillomycin L synthetase B), fenD (fengycin sintetasa), srfAA (subunidad 1 surfactin sintetasa), bacA (proteína de biosíntesis de bacilysin) e iturin (iturin A). Además, mediante el análisis por espectrometría de masas se detectaron bacteriocinas (plipastatin, gramicidin, fengycin, surfactin), proteínas de fijación al intestino (like-enolase), proteinas transportadoras de péptidos antimicrobianos (ABCtransporters) y proteínas de estimulación del sistema inmunitario como flagelin. También se detectaron proteínas tipo colagenasas, chitinasas y xilosa-isomerasas que contribuyen con el proceso de digestión y asimilación. Todos estos resultados permiten considerar los múltiples beneficios de esta cepa para ser utilizada como probiótico en el cultivo de peces.

ResumenLa concha negra Anadara tuberculosa es una especie emblemática del ecosistema manglar que está actualmente en condición vulnerable. El desarrollo de su acuicultura requiere identificar biomarcadores moleculares, en particular asociados al estrés por salinidad en mira al inicio de programas de mejoramiento genético. Se recolectaron ejemplares de Anadara tuberculosa del manglar colindante a la Bahía de Puerto Pizarro (Tumbes, Perú) entre enero 2015 y febrero 2016. Estos individuos fueron sometidos a condiciones de estrés hipo-osmótico (extremo: 5 y 10 ppt); (moderado: 15 y 25 ppt) y sin estrés (grupo control: 33 ppt) por 16 días después de haber sido separados en grupos de diez animales y por triplicado. La presencia de biomarcadores del estrés por salinidad fue evaluada a nivel genético con la detección por PCR de 19 genes reportados como actores claves de la osmorregulación en bivalvos como ostras y mejillones y a nivel proteomico con la secuenciación de péptidos expresados en tejidos de animales expuestos a diferentes salinidades por espectrometría de doble masa. Ninguno de los marcadores genéticos probados pudo ser amplificado por PCR lo que sugiere que A. tuberculosa presente diferencias genéticas significativas en comparación con otros moluscos. El análisis proteómico realizado por MALDI TOF/TOF a nivel de tejido branquial de A. tuberculosa permitió identificar 26 péptidos expresados de formas presenciales y diferenciales a las diferentes salinidades evaluadas, resaltando posibles marcadores como la HSP70 y una proteína transmembrana de transporte de cloruro que están relacionadas con la adaptación a la salinidad. Estas secuencias aminoacídicas permitirán diseñar iniciadores nucleotidicos específicos a A. tuberculosa para la puesta en marcha de futuras investigaciones en ecofisiología de este importante recurso.

AbstractThe pustulose ark A. tuberculosa is an emblematic species of mangrove ecosystem that is currently in a vulnerable condition. The development of its aquaculture, to begin with genetic breeding programs, requires the identification of molecular biomarkers, particularly those associated with salinity stress. With this purpose, specimens of A. tuberculosa were collected from the adjacent mangroves of Puerto Pizarro bay (Tumbes, Perú), from January 2015 to February 2016. Different assays (groups of ten animals in triplicate) were undertaken in separated periods of 16 days: hypo-osmotic stress (extreme: 5, 10 ppt); (Moderate: 15, 25 ppt) and no stress (control group: 33 ppt). The presence of salinity stress biomarkers was assessed at the genetic level throughout PCR detection of 19 genes reported to be key actors in osmoregulation, and at the proteomic level with the sequencing of peptides (tandem mass spectrometry MALDI TOF/TOF), expressed in ark tissues exposed to different salinities. None of the tested genetic markers could be amplified by PCR, suggesting that A. tuberculosa has significant genetic differences compared to other mollusks. Proteomic analysis by mass spectrometry on A. tuberculosa gill tissue, allowed to identify 26 peptides expressed in presential and differential forms at different salinities, highlighting possible markers such as HSP70 and trans-membrane chloride channel transportation protein, to be related with salinity adaptation. These amino acid sequences will allow the design of target specific primers for A. tuberculosa, to implement future research in ecophysiology of this important fishery resource. Rev. Biol. Trop. 65 (3): 1142-1151. Epub 2017 September 01.

ABSTRACT Objectives. To molecularly characterize the pathogenic bacteria of the respiratory tract isolated from patients with cystic fibrosis (CF) in Peru. Materials and methods. Bacterial communities cultured from sputum samples of pediatric and adult patients with CF admitted to the Edgardo Rebagliati Martins National Hospital and the National Institute of Child Health were characterized. Standard microbiological techniques were used for bacterial culture, and gene sequencing of 16S rRNA and matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight (MALDI-TOF) mass spectrometry and tandem MALDI-TOF mass spectrometry (MALDI TOF/TOF) were used for molecular characterization. Results. Seventeen bacterial strains were characterized by 16S rRNA sequencing, and the identified pathogenic bacteria were Pseudomonas aeruginosa (31.5%), Staphylococcus aureus (12.6%), Pseudomonas spp. (11.8%), and Klebsiella oxytoca (3.1%). MALDI-TOF analysis generated a series of spectra representative of each isolated bacterial species, whereas MALDI TOF/TOF analysis identified the peptides and proteins of the most common strains and provided data on pathogenicity and sensitivity to antibiotics. Conclusions. The primary pathogenic microorganisms found in the respiratory tract of patients with CF in Peru were the same as those found in other countries. This study is the first to perform 16S rRNA sequencing as well as MALDI-TOF and MALDI-TOF/TOF analysis of the bacterial pathogens circulating in Peru. The inclusion of proteomic analysis further allowed for the identification of native microorganisms involved in CF.

RESUMEN Objetivos. Caracterizar a nivel molecular las bacterias patógenas de las vías respiratorias de pacientes peruanos con fibrosis quística (FQ). Materiales y métodos. Se caracterizaron las comunidades bacterianas cultivables a partir de muestras de esputo de pacientes pediátricos y adultos con FQ registrados en el Hospital Nacional Edgardo Rebagliati Martins y el Instituto Nacional de Salud del Niño (INSN). Para el cultivo bacteriano se utilizaron técnicas microbiológicas estándares, y para la caracterización molecular la secuenciación del gen ARNr 16S y espectrometría de masas de tipo desorción/ionización con láser asistido por matriz con tiempo de vuelo (MALDI TOF) y MALDI TOF/TOF. Resultados. Por secuenciación del ARNr 16S se identificaron 127 cepas, encontrando las bacterias patógenas Pseudomonas aeruginosa (31,5%), Staphylococcus aureus (12,6%), Pseudomonas spp. (11,8%), Klebsiella oxytoca (3,1%), otras especies mostraron baja prevalencia. El análisis por MALDI TOF permitió obtener una serie de espectros representativos de cada especie aislada, mientras que el análisis por MALDI TOF/TOF reveló péptidos y proteínas de las especies más comunes con informaciones complementarias que revelarían datos sobre su patogenicidad o sensibilidad a antibióticos. Conclusiones. Los principales microorganismos patógenos encontrados en las vías respiratorias son similares a los reportados en otros países. Estos son los primeros hallazgos en Perú que muestran la caracterización bacteriana por secuenciación del ARNr 16S, por MALDI TOF y MALDI TOF TOF. Los hallazgos permiten la identificación bacteriana de microorganismos nativos relacionados con la FQ basada en el análisis de su proteoma.

Objectives. To molecularly characterize the pathogenic bacteria of the respiratory tract isolated from patients with cystic fibrosis (CF) in Peru. Materials and methods. Bacterial communities cultured from sputum samples of pediatric and adult patients with CF admitted to the Edgardo Rebagliati Martins National Hospital and the National Institute of Child Health were characterized. Standard microbiological techniques were used for bacterial culture, and gene sequencing of 16S rRNA and matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight (MALDI-TOF) mass spectrometry and tandem MALDI-TOF mass spectrometry (MALDITOF/TOF) were used for molecular characterization. Results. Seventeen bacterial strains were characterized by 16S rRNA sequencing, and the identified pathogenic bacteria were Pseudomonas aeruginosa (31.5%), Staphylococcus aureus (12.6%), Pseudomonas spp. (11.8%), and Klebsiella oxytoca (3.1%). MALDI-TOF analysis generated a series of spectra representative of each isolated bacterial species, whereas MALDI TOF/TOF analysis identified the peptides and proteins of the most common strains and provided data on pathogenicity and sensitivity to antibiotics. Conclusions. The primary pathogenic microorganisms found in the respiratory tract of patients with CF in Peru were the same as those found in other countries. This study is the first to perform 16S rRNA sequencing as well as MALDI-TOF and MALDI-TOF/TOF analysis of the bacterial pathogens circulating in Peru. The inclusion of proteomic analysis further allowed for the identification of native microorganisms involved in CF.

Objetivos. Caracterizar a nivel molecular las bacterias patógenas de las vías respiratorias de pacientes peruanos con fibrosis quística (FQ). Materiales y métodos. Se caracterizaron las comunidades bacterianas cultivables a partir de muestras de esputo de pacientes pediátricos y adultos con FQ registrados en el Hospital Nacional Edgardo Rebagliati Martins y el Instituto Nacional de Salud del Niño (INSN). Para el cultivo bacteriano se utilizaron técnicas microbiológicas estándares, y para la caracterización molecular la secuenciación del gen ARNr 16S y espectrometría de masas de tipo desorción/ionización con láser asistido por matriz con tiempo de vuelo (MALDI TOF) y MALDI TOF/TOF. Resultados. Por secuenciación del ARNr 16S se identificaron 127 cepas, encontrando las bacterias patógenas Pseudomonas aeruginosa (31,5%), Staphylococcus aureus (12,6%), Pseudomonas spp. (11,8%), Klebsiella oxytoca (3,1%), otras especies mostraron baja prevalencia. El análisis por MALDI TOF permitió obtener una serie de espectros representativos de cada especie aislada, mientras que el análisis por MALDI TOF/TOF reveló péptidos y proteínas de las especies más comunes con informaciones complementarias que revelarían datos sobre su patogenicidad o sensibilidad a antibióticos. Conclusiones. Los principales microorganismos patógenos encontrados en las vías respiratorias son similares a los reportados en otros países. Estos son los primeros hallazgos en Perú que muestran la caracterización bacteriana por secuenciación del ARNr 16S, por MALDI TOF y MALDI TOF TOF. Los hallazgos permiten la identificación bacteriana de microorganismos nativos relacionados con la FQ basada en el análisis de su proteoma.

O objetivo deste trabalho foi selecionar reprodutores de Litopenaeus vannamei sobreviventes de um surto do vírus da síndrome da mancha-branca (WSSV), adaptados às condições locais e diagnosticados negativamente para WSSV e para o vírus da necrose infecciosa hipodermal e hematopoiética (IHHNV), e avaliar se esta extratégia é uma alternativa viável para produção em Santa Catarina. Foram selecionados fenotipicamente 800 machos e 800 fêmeas, de um viveiro. Análises de nested-PCR de 487 fêmeas e de 231 machos, sexualmente maduros, mostraram que 63% das fêmeas e 55% dos machos estavam infectados com IHHNV. Os animais livres de IHHNV foram testados para WSSV, e os considerados duplo negativos destinados à reprodução. As pós-larvas produzidas foram estocadas em nove berçários, para análise. Das 45 amostras, com 50 pós-larvas cada, apenas duas foram positivas para IHHNV e nenhuma para WSSV. Os lotes de pós-larvas diagnosticadas livres de vírus por nested-PCR foram encaminhados para seis fazendas. Foi realizada análise comparativa em viveiros de engorda, entre pós-larvas locais e pós-larvas do Nordeste do Brasil. Também foram analisados caranguejos (Chasmagnathus granulata), siris (Callinectes sapidus) e lebres do mar (Aplysia brasiliana), que são possíveis vetores dos vírus. A média de sobrevivência foi de 55% para as pós-larvas locais e de 23,4% para as pós-larvas do Nordeste. As lebres do mar apresentaram prevalência de 50% e os caranguejos de 67% de WSSV.

The objective of this work was to select surviving breeders of Litopenaeus vannamei from white spot syndrome virus (WSSV) outbreak, adapted to local climatic conditions and negatively diagnosed for WSSV and infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus (IHHNV), and to evaluate if this strategy is a viable alternative for production in Santa Catarina, Brazil. A total of 800 males and 800 females were phenotypically selected in a farm pond. Nested-PCR analyses of 487 sexually mature females and 231 sexually mature males showed that 63% of the females and 55% of the males were infected with IHHNV. Animals free of IHHNV were tested for WSSV, and those considered double negative were used for breeding. The post-larvae produced were stocked in nine nursery tanks for analysis. From the 45 samples, with 50 post-larvae each, only two were positive for IHHNV and none for WSSV. Batches of larvae diagnosed free of virus by nested-PCR were sent to six farms. A comparative analysis was carried out in growth ponds, between local post-larvae and post-larvae from Northeast Brazil. Crabs (Chasmagnathus granulata), blue crabs (Callinectes sapidus), and sea hares (Aplysia brasiliana), which are possible vectors of these viruses, were also evaluated. The mean survival was 55% for local post-larvae against 23.4% for post-larvae from the Northeast. Sea hares showed prevalence of 50% and crabs of 67% of WSSV.