RESUMO: Os nematoides-das-galhas (RKN - Meloidogyne spp.) são uma das mais sérias ameaças à produção de cenoura no mundo. No Brasil, as cenouras são cultivadas ao longo do ano, e as perdas econômicas devido à RKN são frequentemente relatadas. Como pouco se sabe sobre a distribuição de espécies RKN em campos de cenoura no Brasil, coletamos amostras de plantas e solo de 35 campos em seis estados. Baseado na morfologia do padrão perineal, fenótipos de esterase e/ou PCR espécie-específica, três espécies de Meloidogyne foram identificadas: 60% dos campos estavam infestados por Meloidogyne incognita, M. javanica foi encontrada em 42,9% das áreas, enquanto M. hapla foi detectada em 17,1% dos campos de cenoura. Populações mistas foram encontradas em 20% das áreas, com predominância de M. incognita + M. javanica. A combinação de técnicas morfológicas, bioquímicas e moleculares é uma abordagem útil para identificar espécies de RKN.

ABSTRACT: Root-knot nematodes (RKN - Meloidogyne spp.) are one of the most serious threats to carrot production worldwide. In Brazil, carrots are grown throughout the year, and economic losses due to RKN are reported. Since little is known on the distribution of RKN species in carrot fields in Brazil, we collected plant and soil samples from 35 fields across six states. Based on the morphology of perineal patterns, esterase phenotypes and species-specific PCR, three Meloidogyne species were identified: 60% of the fields were infested with Meloidogyne incognita, M. javanica was reported in 42.9% of the areas, whereas M. hapla was detected in 17.1% of carrot fields. Mixed populations were reported in 20% of the areas with a predominance of M. incognita + M. javanica. The combination of morphological, biochemical, and molecular techniques is a useful approach to identify RKN species.

RESUMO: A identificação acurada de espécies do nematoide das galhas (NG) (Meloidogyne spp.) é essencial para a implementação de estratégias de manejo. Métodos baseados na morfologia de adultos, fenótipos de isoenzimas e análise de DNA podem ser usados para a diagnose do NG. Tradicionalmente, as espécies de NG são identificadas pela análise do padrão perineal e fenótipos de esterase. Em ambos os procedimentos, fêmeas maduras são necessárias. Nas últimas décadas, técnicas moleculares acuradas e rápidas têm sido validadas para a diagnose de NG, incluindo ovos, juvenis e adultos como fontes de DNA. Aqui, nós destacamos os métodos usados para a diagnose de NG, incluindo técnicas moleculares emergentes, focando nas principais espécies encontradas no Brasil.

ABSTRACT: The accurate identification of root-knot nematode (RKN) species (Meloidogyne spp.) is essential for implementing management strategies. Methods based on the morphology of adults, isozymes phenotypes and DNA analysis can be used for the diagnosis of RKN. Traditionally, RKN species are identified by the analysis of the perineal patterns and esterase phenotypes. For both procedures, mature females are required. Over the last few decades, accurate and rapid molecular techniques have been validated for RKN diagnosis, including eggs, juveniles and adults as DNA sources. Here, we emphasized the methods used for diagnosis of RKN, including emerging molecular techniques, focusing on the major species reported in Brazil.

Endogenous mechanisms of plant resistance to herbivorous insects could be adapted to enable the development of alternative strategies for pest control. Activation of the lipoxygenase (LOX) pathway by jasmonic acid, the hormone responsible for activating genes encoding protease inhibitors (PI), is one of the main direct defenses of plants against insects. In this study, soybean cultivars at the V3 stage that were either susceptible or resistant to herbivorous insects were used to investigate changes in the activity of LOX and concentration of PIs in response to 24- or 48-h feeding by fourth and fifth instar Anticarsia gemmatalis (Lepidoptera: Noctuidae) larvae. LOX activity (0.0-0.007 nm s-1/mg) and the PI concentration (60 to 125 mg of trypsin inhibitor / mg of protein and 90 to 120 mg of trypsin inhibitor / mg protein after 24 and 48 h after attack, respectively) both increased in response to damage caused by A. gemmatalis. Proteolytic activity decreased by approximately 50% in cultivars with different degrees of resistance. Raised enzyme profiles in the midgut of A. gemmatalis may be related to tryptic enzymes that increased, compensating for the inhibition of proteases by entomotoxic substances of the soybean cultivars.

Los mecanismos de resistencia endógenos de las plantas contra insectos herbívoros pueden permitir el desarrollo de estrategias alternativas para el control de plagas. La activación de la vía de las lipoxigenasas con la producción de ácido jasmónico, hormona responsable por la activación de los genes inhibidores de proteasa, es una de las principales formas de defensa directa de las plantas contra los insectos. En el presente estudio, cultivares de soya en estadio V3, susceptibles y resistentes a insectos herbívoros fueron utilizadas para investigar las alteraciones en la actividad de LOX y la concentración de PIs, en respuesta al ataque de orugas en cuarto y quinto instar de Anticarsia gemmatalis (Lepidóptera: Noctuidae) por 24 y 48 horas. La actividad de LOX (0,00 a 0,007 nm s-1/mg) y la concentración de inhibidores de proteasa (60 a 125 mg de inhibidor de tripsina/ mg de proteína y 90 a 120 mg de inhibidor de tripsina/mg de proteína después de 24 y 48 horas del ataque respectivamente) aumenta en respuesta a los daños ocasionados por A. gemmatalis. La actividad proteolítica disminuyó aproximadamente en 50% en los cultivares con diferentes grados de resistencia. El aumento del perfil enzimático del intestino medio de A. gemmatalis puede estar relacionado al aumento de las enzimas trípticas para compensar la inhibición de proteasas por sustancias entomotóxicas de los cultivares de soya.

Isoformas de cisteíno protease obtidas do intestino médio de lagartas de 5° instar de Anticarsia gemmatalis (Hübner, 1818) foram caracterizadas. A isoforma solúvel foi chamada de Fração Solúvel enquanto a isoforma ligada à membrana celular, de Fração Insolúvel. As maiores atividades foram observadas em pH 3,6 a 45° C para a Fração Solúvel e pH 4,6 a 50° C para a Fração Insolúvel. Ao analisar o efeito de modificadores químicos, a Fração Solúvel mostrou-se insensível à aprotinina e E-64, porém teve sua atividade aumentada pela adição de EDTA e levemente inibida pela adição de íons Ca2+, mostrando se tratar de enzimas independentes de íons metálicos para sua atividade. A Fração Insolúvel também se mostrou insensível à aprotinina, porém teve sua atividade parcialmente inibida por E-64. A adição de EDTA levou a uma redução nos valores de atividade, demonstrando a necessidade de íons metálicos para a atividade dessas enzimas, porém não se trata de enzimas cálcio-dependentes, uma vez que sua atividade foi reduzida com a adição desse íon. Os valores de K M app e Vmáx app foram, respectivamente, 0,6398 mM e 42,556 nM s-1 para Fração Solúvel e 0,0413 mM e 10,854 nM s-1 para Fração Insolúvel. Esses resultados fornecem evidências da presença de cisteíno protease solúvel e ligada à membrana celular do intestino de lagartas de A. gemmatalis. O conhecimento e a caracterização das principais classes de proteases presentes no trato digestivo da lagarta da soja, bem como a interação dessas enzimas com inibidores de protease têm uma importante consequência aos programas de melhoramento de soja.

Cysteine protease isoforms obtained from the midgut of 5th instar Anticarsia gemmatalis (Hübner, 1818) larvae were characterized. The soluble enzyme isoform was called Soluble Fraction and cell membrane-bound enzyme isoform, the Insoluble Fraction. The highest activities were observed at pH 3.6 and 45° C for the Soluble Fraction and pH 4.6 and 50° C for the Insoluble Fraction. Analyzing the effect of chemical modifiers, the Soluble Fraction was shown to be insensitive to aprotinin and E-64, although its activity was increased by the addition of EDTA and slightly inhibited by the addition of Ca2+, showing to be enzymes independent of metal ions to its activity. The Insoluble Fraction was also insensitive to aprotinin, but its activity was partially inhibited by E-64. The addition of EDTA reduced the activity values, demonstrating the need for metal ions for the activity of these enzymes, but they are not calcium-dependent enzymes, since their activity was reduced with the addition of this ion. The values of K M app and Vmax app were, respectively, 0.6398 mM and 42.556 nM s-1 for Soluble Fraction and 0.0413 mM and 10.854 nM s-1 for Insoluble Fraction. These results provide evidence for the presence of soluble and cell membrane-bound cysteine proteases in the gut of A. gemmatalis larvae. The knowledge and characterization of the major classes of proteases produced by the digestive tract of the soybean caterpillar, as well as the interaction of these enzymes with protease inhibitors, have a major implication for soybeans breeding programs.