RESUMO: Apesar da ocorrência comum e importância da cinomose canina, a maioria dos testes atualmente disponíveis para diagnóstico são prejudicados pela baixa sensibilidade ou especificidade. Neste estudo foram avaliadas características antigênicas e imunogênicas de uma região conservada da proteína do nucleocapsídeo do virus da cinomose canina (rCDV NP) expressa em Escherichia coli empregando um gene sintético e codons otimizados. A expressão na cepa Star (média de 300μg/mL, purificada) foi confirmada por SDS-PAGE e Western blot utilizando anticorpos monoclonais anti-His-Tag. A antigenicidade da rCDVNP foi demonstrada por western blot e ELISA empregando soros de cães positivos e negativos. A rCDVNP foi inoculada em galinhas e imunoglobulina Y (gY) foi obtida e purificada a partir da gema. A produção média de IgY foi 28.55mg/mL. Anticorpos IgY reagiram com a proteína recombinante, quando analisados por Western blot e ELISA. Em resumo, nossos achados demonstram que a rCDVNP produzida é antigênica, uma vez que os anticorpos de soro de cães positivos para CDV reconheceram a proteína in vitro. Além disso, a rCDVNP foi imunogênica em galinhas, sendo possível isolar anticorpos IgY específicos a partir da gema do ovo em altas concentrações. Tomados em conjunto, estes resultados indicam que a rCDVNP juntamente com a IgY específica podem ser ferramentas úteis para elaborar ensaios de imunodiagnóstico de cinomose canina.

ABSTRACT: Despite common occurrence and importance of canine distemper disease the majority of tests currently available for diagnosis are hampered by either low sensitivity or specificity. In this study it was evaluated antigenic and immunogenic characteristics of a conserved region of nucleocapsid protein of canine distemper virus (rCDV NP) expressed in Escherichia coli employing a codon optimized synthetic gene. The expression of rCDVNP in Star strain (mean 300μg/mL, purified) was confirmed by SDS-PAGE and Western blot analysis by using His-Tag monoclonal antibodies. Western blot and ELISA, employing positive and negative control dog sera, demonstrated the rCDVNP antigenicity. The rCDVNP was inoculated in hens and immunoglobulin Y (IgY) was purified from the egg yolk. The mean yield of IgY was 28.55mg/mL. IgY reacted with the recombinant protein as demonstrated by Western blot and ELISA assays. In summary, our findings demonstrated that rCDVNP is antigenic since CDV positive dog sera recognized the protein in vitro. Additionally, the rCDVNP proved to be immunogenic in hens being possible to isolate a high concentration of specific IgY antibodies from the egg yolk. Taken together, these results indicate that the rCDVNP along with the specific IgY could be useful tools for development of the canine distemper immunodiagnostic assays.

RESUMO: A atividade antimicrobiana do peptídeo P34 já foi previamente demonstrada. Neste estudo, o potencial antiviral do P34 e o mecanismo de ação in vitro contra o alfaherpesvírus bovino tipo 1 (BoHV1) foram investigados. O P34 exibiu baixa toxicidade, alto índice de seletividade (22.9) e percentagem de inibição viral de até 100% em células MDBK. Os resultados dos ensaios antivirais indicaram que não interage com receptores celulares, mas é capaz de inibir a penetração viral, imediatamente após a pré-adsorção. Além disso, a curva de crescimento do BoHV1 em células MDBK na presença do P34 revelou uma significativa redução no título somente após 8h de infecção, sugerindo também uma importante atividade do peptídeo nas fases finais do ciclo replicativo. Efeito virucida frente / BoHV1 foi observado apenas em concentrações citotóxicas do peptídeo. Os dados obtidos indicam que o peptídeo antimicrobiano P34 pode ser considerado um potencial composto inibidor de herpesvírus, in vitro, e estimulam posteriores investigações sobre sua atividade anti-herpética em modelos animais, bem como contra outros vírus.

ABSTRACT: Previous studies have demonstrated the antimicrobial activity of the peptide P34. In this study, the antiviral potential of P34 and the in vitro mechanism of action were investigated against bovine alphaherpesvirus type 1 (BoHV1). P34 exhibited low toxicity, a high selectivity index (22.9) and a percentage of inhibition of up to 100% in MDBK cells. Results from antiviral assays indicated that P34 did not interact with cell receptors, but it was able to inhibit the viral penetration immediately after pre-adsorption. In addition, BoHV1 growth curve in MDBK cells in the presence of P34 revealed a significant reduction in virus titer only 8h post-infection, also suggesting an important role at late stages of the replicative cycle. Virucidal effect was observed only in cytotoxic concentrations of the peptide. These findings showed that the antimicrobial peptide P34 may be considered as a potential novel inhibitor of in vitro herpesviruses and must encourage further investigation of its antiherpetic activity in animal models as well as against a wide spectrum of viruses.

O modelo construído tem como objetivos a simulação da manutenção, a deposição de proteína na carcaça e nas penas assim como a deposição de gordura na carcaça, e assume a existência de um pool de nutrientes disponíveis no corpo animal, sendo a simulação do metabolismo animal baseada no fluxo de entrada e saída de nutrientes desse pool. Os nutrientes vindos da ingestão de alimentos ou do catabolismo tecidual são removidos do pool com os destinos de mantença, deposição de proteína na carcaça, deposição de gordura na carcaça e deposição de proteína nas penas. O processo de simulação é dinâmico, com as exigências de mantença contabilizadas ao mesmo tempo das deposições de tecidos. Se não houver energia disponível em quantidade adequada para a mantença, o tecido adiposo e o tecido muscular são catabolizados e a energia é disponibilizada e adicionada ao pool de nutrientes. O nitrogênio (N) também é exigido para mantença e deposição do tecido muscular. Se o pool de nutrientes não contiver nitrogênio suficiente para a mantença, tecido muscular é catabolizado para a disponibilização de N. O tecido muscular é depositado numa quantidade determinada pelo potencial genético do animal e pela maior limitação nutricional (nitrogênio ou energia) no pool de nutrientes, da mesma forma que a deposição de proteína nas penas. A quantidade de tecido adiposo depositada depende das reservas de energia no pool de nutrientes, sendo maior quando houver sobra de energia da deposição de proteína na carcaça e nas penas. O efeito de sexo e de diferentes genótipos é expresso através de uma mudança no valor dos parâmetros do modelo. O modelo é eficaz para simular a deposição de proteína e gordura na carcaça bem como a deposição de proteína nas penas.

A model was developed to simulate the basal metabolism, deposition of protein in carcass and feathers, and carcass fat deposition. The model assumes the existence of a pool of readily available nutrients in the animal, simulating metabolism based on the flow of nutrients to and from this pool. Nutrients are originated from feed intake or tissue catabolism, and may be used for maintenance, feather and carcass protein deposition and carcass fat deposition. The simulation process is dynamic, with maintenance and tissue turnover occurring simultaneously. In case energy is insufficient for maintenance, lean and fat tissues are catabolized, and their energy is added to the pool. Nitrogen (N) is also required for maintenance and lean tissue growth. In case of N deficiency, this nutrient is obtained from muscle catabolism. Feather and lean tissue growth is dependent on genetic background and on the largest nutritional limitation (nitrogen or energy) in the nutrient pool. The amount of fat tissue stored depends on the energy available in the pool, being greater when there is excess energy. The effect of sex and different genotypes is expressed through changes in the parameters. The model is able to simulate deposition of protein and fat in the carcass and protein in the feathers.