Endogenous mechanisms of plant resistance to herbivorous insects could be adapted to enable the development of alternative strategies for pest control. Activation of the lipoxygenase (LOX) pathway by jasmonic acid, the hormone responsible for activating genes encoding protease inhibitors (PI), is one of the main direct defenses of plants against insects. In this study, soybean cultivars at the V3 stage that were either susceptible or resistant to herbivorous insects were used to investigate changes in the activity of LOX and concentration of PIs in response to 24- or 48-h feeding by fourth and fifth instar Anticarsia gemmatalis (Lepidoptera: Noctuidae) larvae. LOX activity (0.0-0.007 nm s-1/mg) and the PI concentration (60 to 125 mg of trypsin inhibitor / mg of protein and 90 to 120 mg of trypsin inhibitor / mg protein after 24 and 48 h after attack, respectively) both increased in response to damage caused by A. gemmatalis. Proteolytic activity decreased by approximately 50% in cultivars with different degrees of resistance. Raised enzyme profiles in the midgut of A. gemmatalis may be related to tryptic enzymes that increased, compensating for the inhibition of proteases by entomotoxic substances of the soybean cultivars.

Los mecanismos de resistencia endógenos de las plantas contra insectos herbívoros pueden permitir el desarrollo de estrategias alternativas para el control de plagas. La activación de la vía de las lipoxigenasas con la producción de ácido jasmónico, hormona responsable por la activación de los genes inhibidores de proteasa, es una de las principales formas de defensa directa de las plantas contra los insectos. En el presente estudio, cultivares de soya en estadio V3, susceptibles y resistentes a insectos herbívoros fueron utilizadas para investigar las alteraciones en la actividad de LOX y la concentración de PIs, en respuesta al ataque de orugas en cuarto y quinto instar de Anticarsia gemmatalis (Lepidóptera: Noctuidae) por 24 y 48 horas. La actividad de LOX (0,00 a 0,007 nm s-1/mg) y la concentración de inhibidores de proteasa (60 a 125 mg de inhibidor de tripsina/ mg de proteína y 90 a 120 mg de inhibidor de tripsina/mg de proteína después de 24 y 48 horas del ataque respectivamente) aumenta en respuesta a los daños ocasionados por A. gemmatalis. La actividad proteolítica disminuyó aproximadamente en 50% en los cultivares con diferentes grados de resistencia. El aumento del perfil enzimático del intestino medio de A. gemmatalis puede estar relacionado al aumento de las enzimas trípticas para compensar la inhibición de proteasas por sustancias entomotóxicas de los cultivares de soya.

Isoformas de cisteíno protease obtidas do intestino médio de lagartas de 5° instar de Anticarsia gemmatalis (Hübner, 1818) foram caracterizadas. A isoforma solúvel foi chamada de Fração Solúvel enquanto a isoforma ligada à membrana celular, de Fração Insolúvel. As maiores atividades foram observadas em pH 3,6 a 45° C para a Fração Solúvel e pH 4,6 a 50° C para a Fração Insolúvel. Ao analisar o efeito de modificadores químicos, a Fração Solúvel mostrou-se insensível à aprotinina e E-64, porém teve sua atividade aumentada pela adição de EDTA e levemente inibida pela adição de íons Ca2+, mostrando se tratar de enzimas independentes de íons metálicos para sua atividade. A Fração Insolúvel também se mostrou insensível à aprotinina, porém teve sua atividade parcialmente inibida por E-64. A adição de EDTA levou a uma redução nos valores de atividade, demonstrando a necessidade de íons metálicos para a atividade dessas enzimas, porém não se trata de enzimas cálcio-dependentes, uma vez que sua atividade foi reduzida com a adição desse íon. Os valores de K M app e Vmáx app foram, respectivamente, 0,6398 mM e 42,556 nM s-1 para Fração Solúvel e 0,0413 mM e 10,854 nM s-1 para Fração Insolúvel. Esses resultados fornecem evidências da presença de cisteíno protease solúvel e ligada à membrana celular do intestino de lagartas de A. gemmatalis. O conhecimento e a caracterização das principais classes de proteases presentes no trato digestivo da lagarta da soja, bem como a interação dessas enzimas com inibidores de protease têm uma importante consequência aos programas de melhoramento de soja.

Cysteine protease isoforms obtained from the midgut of 5th instar Anticarsia gemmatalis (Hübner, 1818) larvae were characterized. The soluble enzyme isoform was called Soluble Fraction and cell membrane-bound enzyme isoform, the Insoluble Fraction. The highest activities were observed at pH 3.6 and 45° C for the Soluble Fraction and pH 4.6 and 50° C for the Insoluble Fraction. Analyzing the effect of chemical modifiers, the Soluble Fraction was shown to be insensitive to aprotinin and E-64, although its activity was increased by the addition of EDTA and slightly inhibited by the addition of Ca2+, showing to be enzymes independent of metal ions to its activity. The Insoluble Fraction was also insensitive to aprotinin, but its activity was partially inhibited by E-64. The addition of EDTA reduced the activity values, demonstrating the need for metal ions for the activity of these enzymes, but they are not calcium-dependent enzymes, since their activity was reduced with the addition of this ion. The values of K M app and Vmax app were, respectively, 0.6398 mM and 42.556 nM s-1 for Soluble Fraction and 0.0413 mM and 10.854 nM s-1 for Insoluble Fraction. These results provide evidence for the presence of soluble and cell membrane-bound cysteine proteases in the gut of A. gemmatalis larvae. The knowledge and characterization of the major classes of proteases produced by the digestive tract of the soybean caterpillar, as well as the interaction of these enzymes with protease inhibitors, have a major implication for soybeans breeding programs.

Plants have a type of defense that interferes with the digestive system of insects through the expression of different protease inhibitors (PIs). PIs act by inhibiting proteolytic enzymes in the gut of insects, and may even lead them to death. Therefore, studies have been conducted in order to use these compounds as an alternative method in control of phytophagous insects. The Thyrinteina leucoceraea is prague on eucalypts, but does not cause severe damage in leaves of guava, so it is interesting that the defense of this plant is investigated. Thus, this work studied the enzymatic response of the caterpillar T. leucoceraea further concentration of benzamidine PI (PI synthetic of serine proteases) applied to the leaves of guava in order to evaluate the effects of synthetic inhibitor in conjunction with the natural inhibitor produced by these plants. For this investigation, we used three different concentrations of benzamidine, 0.12, 0.25 and 0.5%. It was found that the guava produce IPs in response to defense and that the benzamidine applied on leaves of guava interfere in the activity of serine proteases in the gut of larvae of T. leucoceraea. However, it can also be observed that the caterpillars were adapted to the ingestion of PIs by increasing the activity of cysteine proteases in almost all treatments.

As plantas têm um tipo de defesa que interfere no sistema digestivo dos insetos através da expressão de diferentes inibidores de proteases (IPs). Os IPs agem inibindo enzimas proteolíticas no intestino dos insetos, podendo até levá-los à morte. Por isso, estudos têm sido realizados visando à utilização desses compostos como método alternativo no controle de insetos fitófagos. As lagartas de Thyrinteina leucoceraea causam muitos danos em eucaliptais, mas não conseguem se desenvolver bem em folhas de goiabeira, portanto é interessante que a defesa desta planta seja investigada. Sendo assim, este trabalho estudou a resposta enzimática da lagarta T. leucoceraea ao aumento da concentração do IP benzamidina (IP sintético de serino-proteases) aplicado sobre as folhas de goiabeira, a fim de estudar a ação do inibidor sintético em conjunto com o inibidor natural produzido por essas plantas. Para tal investigação, foram utilizadas três diferentes concentrações de benzamidina: 0, 12, 0,25 e 0,5%. Verificou-se que as goiabeiras produzem IPs como resposta de defesa e que a benzamidina aplicada nas plantas de goiaba interferiu na atividade das serino-proteases no intestino de lagartas de T. leucoceraea, entretanto, pode-se observar também que as lagartas apresentaram adaptação à ingestão dos IPs através do aumento da atividade de cisteíno-proteases em quase todos os tratamentos.

O uso da soja [Glycine max (L.) Merrill] na alimentação humana tem encontrado dificuldades devido ao seu sabor característico (beany flavor), que é derivado da ação das lipoxigenases (EC 1.13.11.12). Ao contrário das lipoxigenases de sementes de soja, que têm sido extensivamente estudadas, a diversidade e características das lipoxigenases de folhas não estão totalmente elucidadas. Sabe-se que além de sua atividade catalítica, as lipoxigenases de folhas estão envolvidas no armazenamento temporário de nitrogênio e na resposta da planta ao estresse. Com o objetivo de investigar o efeito da remoção dos primórdios florais na atividade das lipoxigenases de folhas de soja, foram utilizados dois genótipos de soja: IAC-100, uma variedade com presença de lipoxigenases na semente e IAC-100 TN, uma linhagem com ausência completa de lipoxigenases na semente. Por meio de dados da cinética enzimática, foram constatados dois picos mais acentuados de atividade em pH 5,0 e 6,5, com temperatura ótima de 25ºC. Para ambos os genótipos, as atividades foram maiores nos tratamentos que nos respectivos controles. Os valores de KM app aos 16 dias, nas plantas-controle, foram semelhantes para os dois genótipos, sugerindo não haver influência da manipulação genética das lipoxigenases na semente em relação à expressão dos genes que codificam as lipoxigenases de folhas. No entanto, os valores de KM app foram diferentes entre a fase vegetativa e a reprodutiva, em ambos genótipos, indicando pools distintos de isoenzimas lipoxigenases entre as duas fases.

The use of soybean [Glycine max (L.) Merrill] as human food has been encountered difficulties due to beany flavor. The beany flavour is originated from lipoxygenases (EC 1.13.11.12). Soybean seed lipoxygenases have been extensively studied, however, the diversity and characteristics of lipoxygenases present in leaves are still being studied. Besides its catalytic activity, lipoxygenases from soybean leaves have been implicated in temporary nitrogen storage and response to stress. The primary objective of this research was to investigate the effect of floral primordial elimination (sink deprivation) on soybean leaves lipoxygenases activity. Two different genotypes differing in the presence (IAC-100) or absence (IAC-100 TN) of LOX in their seeds were used. The enzymatic kinetics analysis showed two pronounced peaks of activity at pH 5 and 6.5, with optimal temperature of 25ºC. The KM app values were similar for both genotypes suggesting that there was not effect of genetic manipulation of seeds lipoxygenases on genes expression that code for leave lipoxygenases. However, the KM app values were different between the vegetative and reproductive development stage, suggesting that there are differents pool of lipoxygenases between the two stages.

Neste trabalho, avaliou-se a capacidade da planta de soja de uma cultivar comercial, IAC-100, e de um genótipo IAC-100 TN que apresenta ausência de lipoxigenases nas sementes de responderem ao ataque de mosca-branca (Bemisia argentifolii) pela via das Lipoxigenases. Foi realizada a caracterização cinética do pool de lipoxigenases. Os valores de KMapp decresceram nas plantas atacadas, sugerindo uma alteração no pool de lipoxigenases foliares. Valores similares de KMapp, entre os genótipos, indicam que a remoção de lipoxigenases de sementes não interferiram na expressão de lipoxigenases em folhas. Ocorreu aumento significativo na produção de inibidores de proteases. Com esses resultados, infere-se que a produção de inibidores de proteases está envolvida no mecanismo de defesa de soja ao ataque da mosca-branca.

This work evaluated the capacity of the soybean plant, from a commercial cultivar IAC-100 and from a genotype IAC-100 TN, with absence of lipoxygenases in their seeds, to respond to the attack by whitefly (sucking insect) by lipoxygenases pathway. The kinetic characterization of the “pool” of lipoxygenases was determined. The KMapp values decreased, suggesting a change in the “pool” of lipoxygenases in response to the attack by whitefly. The similar KMapp values suggest that the removal of the lipoxygenases from the seeds does not change the expression of LOX in the leaves. There was a noticeable increase in protease inhibitors. These results suggest that the production of protease inhibitors are involved in the defense mechanism of soybean plant against whitefly injury.