RESUMO Este estudo teve como objetivo avaliar a morfometria ultraestrutural de embriões bovinos produzidos in vitro e cultivados em diferentes concentrações de antioxidantes. Após a maturação e a fertilização in vitro, os possíveis zigotos foram divididos em cinco tratamentos: T1) sem adição de antioxidantes (controle negativo); T2) adição de 50μM/mL de cisteamina; e T3, T4 e T5) adição de 2,5μg/mL, 5,0μg/mL ou 10,0μg/mL dos antioxidantes derivados do extrato oleoso de Lippia origanoides, respectivamente. No D7 de cultivo, os embriões em estágio de blastocisto foram fixados e preparados para microscopia eletrônica de transmissão. Estes foram avaliados para a proporção entre citoplasma e núcleo, citoplasma e mitocôndria, citoplasma e vacúolos, citoplasma e vacúolos autofágicos e citoplasma e gotículas lipídicas. Blastocistos cultivados em meio contendo extrato oleoso de Lippia origanoides apresentaram características morfológicas como alta relação célula:mitocôndria e baixa relação célula:vacúolos e célula:vacúolo autofágico, possíveis indicadores morfológicos de qualidade embrionária. A massa celular interna (MCI) de blastocistos cultivados em meio sem quaisquer antioxidantes teve a maior razão célula:vacúolo. Resultados semelhantes foram encontrados nas células do trofectoderma (TE) de blastocistos do tratamento 2. Portanto, o meio de cultivo embrionário suplementado com antioxidantes derivados do óleo de Lippia origanoides produziu embriões com maior proporção citoplasmática de organelas, como mitocôndrias. Além disso, tratamentos sem antioxidantes ou com adição de cisteamina apresentaram vacuolização citoplasmática, característica relacionada à produção de embriões de baixa qualidade.

ABSTRACT This study aimed to evaluate the ultrastructural morphometry of bovine embryos produced in vitro grown at different concentrations of antioxidants. After in vitro maturation and fertilization, the presumptive zygotes were assigned into five treatments. T1) without the addition of any antioxidants (negative control); T2) addition of 50μM/mL cysteamine; and T3, T4 and T5) adding 2.5μg/mL, 5.0μg/mL or 10.0μg/mL of the antioxidants derived from the oily extract from Lippia origanoides, respectively. On D7 of culture, the embryos in the blastocyst stage were fixed and prepared for electron transmission microscopy. These were evaluated for the proportion of cytoplasm-to-nucleus, cytoplasm-to-mitochondria, cytoplasm-to-vacuoles, cytoplasm-to-autophagic vacuoles and cytoplasm-to-lipid droplets. Blastocysts cultured in media containing oily extract of Lippia origanoides presented morphological characteristics such as high cell:mitochondria ratio and low cell:vacuoles and cell:autophagic vacuole ratio, possibly been morphological indicators of embryonic quality. Inner cell mass (ICM) from blastocysts cultured in media without any antioxidants had the highest cell:vacuole ratio. Similar results were found in the trophectoderm (TE) cells of blastocysts from treatment 2. Embryo culture media supplemented with antioxidants derived from Lippia origanoides oil produced embryos with a higher cytoplasmic proportion of organelles, such as mitochondria. Also, treatments without any antioxidants or with the addition of cysteamine presented cytoplasmic vacuolization, a characteristic related to production of poor-quality embryos.

RESUMO O objetivo desse estudo foi avaliar a suplementação de meio de cultura de embriões com antioxidante obtido do extrato oleoso da Lippia origanoides no desenvolvimento e na qualidade de blastocistos produzidos in vitro. Oócitos coletados de ovários de matadouros foram maturados e fertilizados in vitro segundo procedimento laboratorial padrão. Zigotos foram cultivados em meio SOF suplementado de acordo com os seguintes tratamentos: T1) meio de cultivo embrionário sem suplementação antioxidantes; T2) 50μM/mL Cisteamina; T3) 2,5μg/mL; T4) 5,0μg/mL e T5) 10,0μg/mL do antioxidante obtido do extrato oleoso de Lippia origanoides. No sétimo dia de cultivo, os blastocistos foram fixados e avaliados para taxa de apoptose, número total de células e massa celular interna através do teste TUNEL. O uso de antioxidantes durante cultivo não aumentou (P>0,05) a taxa de produção final de blastócitos. Os tratamentos T2, T3, T4 e T5 tiverem menor índice apoptótico (p>0,05 - 4,5±1,1%, 8,4±2,5%, 3,4±1,1% e 5,5±0,9%, respectivamente) quando comparados a T2 (10,0±1,4%). O valor de massa celular interna não diferenciou (p>0,05) entre embriões de diferentes tratamentos. A adição de antioxidante obtido do extrato oleoso de Lippia origanoides reduziu a taxa de apoptose e melhorou a qualidade sem aumentar a produção in vitro de embriões bovinos.

ABSTRACT The aim of this study was to evaluate the supplementation of embryo culture medium with antioxidant obtained from oily extract of Lippia origanoides on in vitro blastocyst development and quality. Oocytes collected from slaughterhouse ovaries were matured and fertilized in vitro following standard laboratory procedures. Zygotes were cultured in SOF medium supplemented according to the following treatments: T1 embryo culture medium without antioxidant supplementation; T2)50μM/mL Cysteamine; T3)2.5μg/mL; T4)5.0μg/mL and T5)10.0μg/mL of antioxidant obtained from oily extract of Lippia origanoides. On the seventh day of culture, the blastocysts were fixed and evaluated for apoptosis rates, number of total cell and inner cell mass cells by means of the TUNEL Test. The use of antioxidants during cultivation did not increase (P> 0.05) the final blastocyst production rate. The treatments T2, T3, T4 and T5 had the lowest (P< 0.05) apoptotic indexes (4.5±1.1%, 8.4±2.5%, 3.4±1.1% and 5.5±0.9%, respectively) when compared to T1 treatment (10.0±1.4%). The number of inner cell mass did not differ (P> 0.05) among embryos from different treatments. The addition of antioxidant obtained from oily extract of Lippia origanoides reduces the apoptosis rate and improves the quality without increasing the total in vitro production of bovine embryos.

RESUMO Na medicina veterinária, a terapia celular ainda é inexplorada e há muitas perguntas não respondidas, o que leva os pesquisadores a uma tendência a estender a terapia para os seres humanos, na tentativa de tratar certas lesões. Investigar esse assunto em primatas não humanos revela-se uma oportunidade sem precedentes para compreender melhor a dinâmica das células-tronco contra algumas doenças. Assim, objetivou-se comparar a eficiência das células mononucleares de medula óssea (BMMCs) e das células-tronco mesenquimais (MSCs) do tecido adiposo de Chlorocebus aetiops na lesão óssea induzida. Foram utilizados 10 animais, adultos do sexo masculino, submetidos à lesão óssea nas cristas ilíacas. As MSCs foram isoladas e cultivadas; de forma autóloga, as BMMCs foram infundidas na crista ilíaca direita e as MSCs de tecido adiposo na crista ilíaca esquerda. Após 4,8 meses, a crista ilíaca direita foi totalmente reconstruída, enquanto a crista ilíaca esquerda continuou apresentando defeito ósseo evidente por até 5,8 meses após a infusão. A melhor opção para o tratamento de lesões com perda de tecido ósseo em primatas do Velho Mundo é a utilização de MSCs autólogas de tecido adiposo, sugerindo que se podem estender os resultados para seres humanos, uma vez que há proximidade filogenética entre as espécies.

ABSTRACT In veterinary medicine, the cell therapy is still unexplored and there are many unanswered questions that researchers tend to extrapolate to humans in an attempt to treat certain injuries. Investigating this subject in nonhuman primates turns out to be an unparalleled opportunity to better understand the dynamics of stem cells against some diseases. Thus, we aimed to compare the efficiency of bone marrow mononuclear cells (BMMCs) and mesenchymal stem cells (MSCs) from adipose tissue of Chlorocebus aethiops in induced bone injury. Ten animals were used, male adults subjected, to bone injury the iliac crests. The MSCs were isolated by and cultured. In an autologous manner, the BMMCs were infused in the right iliac crest, and MSCs from adipose tissue in the left iliac crest. After 4.8 months, the right iliac crests fully reconstructed, while left iliac crest continued to have obvious bone defects for up to 5.8 months after cell infusion. The best option for treatment of injuries with bone tissue loss in old world primates is to use autologous MSCs from adipose tissue, suggesting we can extrapolate the results to humans, since there is phylogenetic proximity between species.

RESUMO Esta pesquisa avaliou a dinâmica dos leucócitos e das subpopulações de linfócitos em vacas Holandesas soropositivas para o BLV no período de transição. Amostras de sangue (n=72) provenientes de 12 vacas foram coletadas entre as semanas -2 e +3 para a realização do leucograma, imunofenotipagem, dosagem de cortisol e haptoglobina (Hp). O perfil leucocitário foi caracterizado por leucocitose, neutrofilia, monocitose e eosinopenia próximo ao parto. Linfocitose e elevada proporção de linfócitos B CD21+ foram achados constantes entre as semanas -2 e +3; assim, as vacas foram testadas e confirmadas soropositivas para o BLV. Os valores das subpopulações de linfócitos T apresentaram-se baixos durante o período de transição, observando-se dois picos máximos que coincidiram com as elevações nas concentrações de cortisol no parto (2,11µg/dL) e semana +3 (1,97µg/dL). Hp apresentou aumento crescente de -2 (166µg/mL) a +3 (576µg/mL), provavelmente associada à elevada taxa de infecções uterinas observadas nas semanas +2 e +3. As vacas soropositivas para o BLV apresentaram leucograma de estresse próximo ao parto, exceto para linfócitos. A linfocitose e as elevadas proporções de células B CD21+, associadas com as baixas proporções de células T, podem ser indicativo de imunossupressão e predisposição aos processos inflamatórios no período pós-parto.

ABSTRACT This research evaluated the dynamics of leukocytes and lymphocytes subsets in seropositive Holstein cows for BLV during the transition period. Blood samples (n=72) from 12 cows were harvested from week -2 up to week +3 to perform leukogram, immunophenotyping, cortisol and haptoglobin (Hp). Leukocytes pattern was characterized by leukocytosis, neutrophilia, monocytosis and eosinopenia around calving. Lymphocytosis and high proportions of B cells CD21+ were a constant finding between week -2 and +3, thus cows were tested and confirmed seropositive for BLV. The values of T lymphocytes subsets were low during the transition period, observing two peaks that coincided with high levels of cortisol at delivery (2.11µg/dL) and week +3 (1.97µg/dL). Hp had gradual increase from week -2 (166µg/mL) until week +3 (576g/mL) probably due to high rate of uterine infection detected between week +2 and +3. The seropositive cows for BLV presented stress leukogram around delivery, except for lymphocytes. Lymphocytosis and the high proportions of B cells, associated with the low proportions of T lymphocytes, can be indicative of immunosuppression and predisposition to the inflammatory process observed in the post-partum period.

A quercetina é um flavonoide, amplamente encontrada em frutas, vegetais, grãos, flores, com elevada concentração no vinho tinto, e tem sido caracterizada funcionalmente pela atividade antioxidante. Para avaliação da maturação nuclear e do desenvolvimento embrionário bovino, os oócitos foram maturados por 22h na presença de quercetina (0,4, 2, 10 e 50µM), cisteamina (100µM) e na ausência dos antioxidantes. Os oócitos maturados foram corados com Hoechst para avaliação da maturação in vitro. Para avaliação do desenvolvimento embrionário, os oócitos foram fertilizados e cultivados in vitro, as taxas de desenvolvimento embrionário foram determinadas no sétimo dia de cultivo e o percentual de eclosão e o número de células dos embriões no oitavo dia. Os níveis de glutationa (GSH) dos oócitos foram mensurados por emissão de fluorescência com CMF2HC. A porcentagem de maturação nuclear (±89%) não diferiu entre os grupos. O desenvolvimento embrionário variou entre os tratamentos, o percentual de blastocisto foi superior (P<0,05) nos grupos tratados com 0,4, 2, 10 e 50∝M de quercetina (56,9, 59,5, 53,6 e 49,6%, respectivamente) e com 100∝M de cisteamina (50,4%) em relação ao grupo controle (42,3%). Na comparação entre os dois antioxidantes, a quercetina (0,4 e 2µM) foi superior na produção de embriões (56,9 e 59,5%, respectivamente) em comparação com cisteamina (50,4%). As taxas de embriões eclodidos foram similares (P>0,05) entre os grupos (±63,0%). O número médio de células dos embriões também foi similar entre os grupos (±233). Os níveis intracelulares de GSH foram superiores nos oócitos maturados com cisteamina, mas similares entre os oócitos tratados com quercetina e o controle. A suplementação da maturação in vitro com antioxidantes melhora as taxas de blastocistos. A quercetina foi superior à cisteamina, que, por sua vez, foi superior ao controle. Mas os níveis de GSH foram superiores somente nos oócitos tratados com cisteamina.

Quercetin is a flavonoid widely found in fruit, vegetables, grains and flowers, with a high concentration in red wine, and has been functionally characterized by its antioxidant activity. For assessment of nuclear maturation and bovine embryo, oocytes were matured for 22h in the presence of quercetin (0.4, 2, 10 and 50µM), cysteamine (100µM) and in the absence of antioxidants. The matured oocytes were stained with Hoechst to evaluate the in vitro maturation. To assess embryonic development, oocytes were fertilized and cultured in vitro and rates of embryo development were obtained in the seventh day of culture and the percentage of hatching and the number of cells on eighth day embryos. The levels of glutathione (GSH) of the oocytes were measured by fluorescence emission with CMF2HC. The percentage of nuclear maturation (±89%) did not differ between groups. Embryonic development varied between treatments, the percentage of blastocyst was higher (P<0.05) in the groups treated with 0.4, 2, 10 and 50∝M of quercetin (56.9, 59.5, 53.6 and 49.6%, respectively) and 100 ∝M cysteamine (50.4%) compared to the control group (42.3%). Comparing the two antioxidants, quercetin (0.4 to 2µM) was superior in embryo production (56.9 and 59.5% respectively) compared with cysteamine (50.4%). The rates of hatched embryos were similar (P>0.05) between groups (±63.0%). The average number of embryo cells was also similar in both groups (±233). The intracellular GSH levels were higher in oocytes matured with cysteamine, but similar between the oocytes treated with quercetin and control. The supplementation of matured in vitro with antioxidants improves blastocyst rates. Quercetin was greater than cysteamine, which in turn was superior to the control. However, GSH levels were higher in oocytes treated only with cysteamine.

Spirulina maxima, which is used as a food additive, is a microalga rich in protein and other essential nutrients. Spirulina contains phenolic acids, tocopherols and ß-carotene which are known to exhibit antioxidant properties. The aim of the present study was to evaluate the antioxidant capacity of a Spirulina extract. The antioxidant activity of a methanolic extract of Spirulina was determined in vitro and in vivo. The in vitro antioxidant capacity was tested on a brain homogenate incubated with and without the extract at 37oC. The IC50 (concentration which causes a 50% reduction of oxidation) of the extract in this system was 0.18 mg/ml. The in vivo antioxidant capacity was evaluated in plasma and liver of animals receiving a daily dose of 5 mg for 2 and 7 weeks. Plasma antioxidant capacity was measured in brain homogenate incubated for 1 h at 37oC. The production of oxidized compounds in liver after 2 h of incubation at 37oC was measured in terms of thiobarbituric acid reactant substances (TBARS) in control and experimental groups. Upon treatment, the antioxidant capacity of plasma was 71% for the experimental group and 54% for the control group. Data from liver spontaneous peroxidation studies were not significantly different between groups. The amounts of phenolic acids, <FONT FACE="Symbol">a</FONT>-tocopherol and ß-carotene were determined in Spirulina extracts. The results obtained indicate that Spirulina provides some antioxidant protection for both in vitro and in vivo systems.