RESUMEN La papa (Solanum tuberosum) es uno de los productos agrícolas con mayor demanda interna en Colombia. Este cultivo es afectado por un complejo de virus que reduce los rendimientos y la calidad de los tubérculos-semilla. En este trabajo se evaluó la prevalencia de cinco virus de ARN (PVY, PVS, PVX, PLRV y PYVV) en brotes de tubérculos-semilla de origen comercial (TC) y no-comercial (TNC) y en sus plantas derivadas, utilizando RT-PCR en tiempo real. Los resultados evidenciaron altos niveles de infección de los cinco virus en el material de siembra e infecciones mixtas hasta con cuatro virus en los tubérculos comerciales. PVY (74%) y PVS (36%) presentaron los mayores niveles de prevalencia en plantas derivadas de tubérculos-semilla. La combinación PVY+PLRV presentó el mayor nivel de prevalencia en tubérculos-semilla TC (24%), mientras que en TNC las combinaciones PVY+PYVV+PVS y PVY+PVS+PLRV se presentaron en 10% de las muestras. La afinidad filogenética de los virus detectados se evaluó mediante secuenciación Sanger de amplicones de cápside, agrupándose en subclados previamente identificados sobre solanáceas en Colombia. Estos resultados señalan la necesidad de tomar acciones urgentes que permitan mejorar los niveles de sanidad viral de los materiales de siembra de papa cultivados en el país.

ABSTRACT Potato (Solanum tuberosum L.) is one of the agricultural products with highest internal demand in Colombia. However, this crop is affected by a virus complex that have a dramatic effect in yields and on the quality of tuber-seeds. In this work we tested the prevalence of five RNA viruses (PVY, PVS, PVX, PLRV and PYVV) in tuber-seed sprouts and their corresponding plantlets using real-time RT-PCR. Tuber-seeds were obtained from commercial (TC) and informal seed (TNC) distributors. Our results suggest high levels of infection with all five viruses in seed potatoes. Mixed infections, with up to four different viruses, were found with high frequency in certified or registered seed tubers. PVY (74%) and PVS (36%) were the most prevalent viruses using leaf tissues. The combination PVY+PLRV (24%) was the most common mixed infection in commercial tuber-seeds. In non-commercial seeds the most prevalent mixed infections were PVY+PYVV+PVS and PVY+PVS+PLRV at 10%. The phylogenetic affinity of all viruses under study was determined by partial sequencing of their CP genes, which confirmed their close relationship with previously characterized Colombian strains. These results underscore the urgent need to improve the health status in potato seed-tubers used by farmers in Colombia.

RESUMO A batata (Solanum tuberosum) é um dos produtos agrícolas com maior demanda interna na Colômbia. Este cultivo é afetado por um complexo de vírus que reduzem os rendimentos e a qualidade dos tubérculos-semente. Neste trabalho foi avaliada a prevalência de cinco vírus de ARN (PVY, PVS, PVX, PLRV y PYVV) em brotos de tubérculos-semente de origem comercial (TC) e não comercial (TNC) e em plantas derivadas desses brotos, usando RT-PCR em tempo real. Os resultados evidenciaram altos níveis de infecção dos cinco vírus no material de semeadura e infecções mistas com até quatro vírus nos tubérculos comerciais. PVY (74%) e PVS (36%) apresentaram os maiores níveis de prevalência em plantas derivadas de tubérculos-semente. A combinação PVY+PLRV apresentou o maior nível de prevalência em tubérculos-semente TC (24%), enquanto em TCN as combinações PVY+PYVV+PVS e PVY+PVS+PLRV foram detectadas em 10% das amostras. A afinidade filogenética dos vírus detectados foi avaliada por sequenciamento Sanger de amplicons da cápside, agrupandose em subclados previamente identificados sobre solanáceas na Colômbia. Estes resultados indicam a necessidade de tomar ações urgentes para melhorar os níveis de sanidade viral dos materiais de semeadura de batata no país.

RESUMEN En Antioquia, el cultivo de tomate (Solanum lycopersicum) se ve afectado por diversas enfermedades virales, que ocasionan la disminución en la calidad de los frutos y de los rendimientos; sin embargo, pocos estudios han identificado, a nivel de especie, los agentes causales de dichas enfermedades. En los últimos años, la secuenciación de alto rendimiento (HTS), se ha convertido en una herramienta eficiente de diagnóstico de fitopatógenos, permitiendo la detección y la caracterización genómica de un alto número de virus, en diferentes plantas. En este trabajo, se evaluó la presencia de virus de ARN infectando tomate var. Chonto del oriente Antioqueño, mediante HTS y RT-PCR, en tiempo real (RT-qPCR), en muestras de tejido foliar y en semillas. El análisis de HTS indicó la infección de los virus Potato virus S (PVS), Potato virus Y (PVY), Potato yellow vein virus (PYVV), Potato virus X (PVX), Southern tomato virus (STV) y Bell pepper endornavirus (BPEV), en los cultivos de tomate de esta región, obteniéndose los genomas completos de PYVV, STV y BPEV. Las pruebas de RT-qPCR indicaron la presencia de PYVV en el 100% de las muestras foliares analizadas, mientras que PVX, PVY, STV y PVS, se encontraron en niveles de 94,4, 77,8, 72,2 y 5,6%, respectivamente. La evaluación de estos virus en lotes de semilla sexual comercial y no comercial y en sus plantas derivadas evidenció la presencia de cinco virus en dicho material, con niveles de prevalencia del 13 al 93% e infecciones mixtas, que incluyeron combinaciones, desde dos a cinco virus.

ABSTRACT In Antioquia, the tomato crop (Solanum lycopersicum) is seriously affected by a wide range of viral diseases that affect yield and the quality of fruits. Despite of this, there are few studies aimed at identifying these viruses at the species level. With the advent of High-throughput sequencing (HTS) methods, it is now possible to achieve an efficient characterization of viruses infecting plant hosts. In this work, the presence of RNA viruses infecting tomato var. Chonto in eastern Antioquia was tested using HTS and Real-time RT-PCR (RT-qPCR) in leaf tissues and seeds. HTS revealed infection with Potato virus S (PVS), Potato virus Y (PVY), Potato yellow vein virus (PYVV), Potato virus X (PVX), Southern tomato virus (STV) and Bell pepper endornavirus (BPEV). Complete genome sequences were obtained for PYVV, STV and BPEV. RT-qPCR showed prevalence of 100%, 94.4%, 77.8%, 72.2% and 5.6% for PYVV, PVX, PVY, STV and PVS in leaf samples, respectively. These viruses were also found infecting commercial and informal seeds and in their seedlings with a prevalence between 13 and 93%. Mixed infections were found to combine a mixture of two to five viruses.

RESUMEN El Potato virus Y (PVY) es uno de los virus más limitantes para la producción de papa (Solanum tuberosum y S. phureja) en el mundo. Este virus es transmitido por tubérculo-semilla de papa y por diferentes especies de áfidos. Para su manejo es fundamental la siembra de tubérculos certificados por su sanidad viral, para lo que se requieren metodologías de detección altamente sensibles como ELISA y RT-PCR. Para éstas últimas pruebas, es necesario disponer de cebadores específicos que permitan el diagnóstico del virus en tejidos asintomáticos. En este estudio se reportan los cebadores PVY_Col para la detección del PVY en RT-PCR convencional y en tiempo real (RT-qPCR). Estos cebadores fueron diseñados con base en las secuencias de este virus que se han reportado en Colombia sobre diferentes hospedantes, así como de las diferentes variantes encontradas en el mundo. Una particularidad adicional de estos cebadores es que no presentan reacción cruzada con el genoma del Potato virus V (PVV), otro potyvirus que recientemente se ha encontrado afectando cultivos de papa en Colombia. Se espera que los cebadores PVY_Col sean utilizados para apoyar los programas de certificación de material de siembra de papa, así como para adelantar estudios epidemiológicos y de manejo fitosanitario de este virus.

ABSTRACT Potato virus Y (PVY) is one of the most limiting viruses in the production of potato (Solanum tuberosum and S. phureja) worldwide. This virus is transmitted by aphids and infected tuber-seeds, and for this reason, disease management of PVY requires, among others, using certified planting material through highly sensitive techniques such as ELISA and RT-PCR. However, RT-PCR-based methods require primers of high specificity to allow the unequivocal detection of viruses in asymptomatic tissues. In this work, we report a new set of primers (PVY_Col) for detection of PVY by RT-PCR and real-time RT-PCR (RT-qPCR). These primers were designed using sequences of PVY isolates from Colombia and the rest of the world. An essential feature of these primers is their specificity, since they don't amplify templates from Potato virus V (PVV), a close PVY relative that also infects potato crops in Colombia. It is expected that the PVY_Col primer set will be useful to support potato seed certification programs, epidemiological studies, and PVY disease management programs.

RESUMEN Las enfermedades virales son uno de los principales problemas fitopatológicos de la papa. Con el fin de determinar los virus más prevalentes en cultivos de papa var. Diacol Capiro en el oriente Antioqueño (Colombia), se evaluó mediante RT-qPCR la presencia de diez virus de ARN (PVY, PVA, PVV, TaLMV, PVS, PLRV, PYVV, PVX, ToRSV y PMTV) en 36 muestras de tejido foliar. Los resultados indicaron la ocurrencia de cinco de los diez virus evaluados, con niveles de prevalencia de 88,9 %, 75 %, 75 %, 41,7 % y 25 % para PVY, PVX, PYVV, PLRV y PVS, respectivamente. Con fines comparativos, cuatro virus también se evaluaron mediante ELISA, siendo detectados PVS (80,5 %), PVY (55 %) y PLRV (5,5 %); mientras que PVX no fue encontrado con esta prueba. La comparación de estas técnicas mediante la razón de prevalencia (RP), indicó que la RT-qPCR ofrece niveles superiores de detección con valores de RP = 1,6 y RP = 7,5 para los virus PVY y PLRV; mientras que para PVS la ELISA detectó más muestras positivas que RT-qPCR (RP = 3,22), evidenciándose la necesidad de diseñar nuevos cebadores ajustados a la diversidad de este virus en Antioquia. La coinfección mixta más frecuente fue PVY-PYVV-PVX (22,2 %), mientras que los cinco virus se encontraron en el 11,1 % de las muestras. Finalmente, utilizando secuenciación Sanger de la cápside y NGS para los genomas completos, se confirmó la circulación de todos los virus detectados en los cultivos de papa del oriente Antioqueño. Estos resultados señalan la necesidad de fortalecer los programas de manejo integrado de enfermedades virales en Antioquia.

ABSTRACT Viral diseases are one of the main phytopathological problems affecting potato crops worldwide. To determine the most prevalent viruses in potato var. Diacol Capiro crops in Eastern Antioquia, 36 leaf samples were tested for the presence of PVY, PVA, PVV, TaLMV, PVS, PLRV, PYVV, PVX, ToRSV and PMTV using RT-qPCR. Detected viruses included PVY, PVX, PYVV, PLRV and PVS with prevalence levels of 88.9 %, 75.0 %, 75.0 %, 41.7 % and 25.0 %, respectively. PVS, PVY, PLRV and PVX were also tested by ELISA. PVS, PVY and PLRV tested positive in 80.5 %, 55.0 % and 5.5 % of samples; PVX was not detected. Prevalence Ratios (PR) suggests that detection is higher for PVY (PR = 1.6) and PLRV (PR = 7.5) using RT-qPCR. ELISA worked better for PVS with a PR of 3.2; this result suggests that the RT-qPCR primers used for PVS must be adjusted to reflect the genome diversity of virus in Antioquia. The most frequent coinfection was PVY-PYVV-PVX, which occurred in 22.2 % of samples; coinfection with PVY, PVX, PYVV, PLRV and PVS was present in 11.1 % of samples. The circulation of these viruses in Eastern Antioquia was further confirmed using Sanger and high-throughput sequence. This work highlights the need to strengthen integrated disease management programs of viruses in Antioquia.

RESUMEN El maracuyá morado (Passiflora edulis f. edulis), también conocido como gulupa, es una planta enredadera de la familia Passifloraceae, que recientemente ha tomado importancia en el mercado mundial de frutas exóticas, gracias a sus excelentes características organolépticas. Aunque la demanda de gulupa en Colombia se ha incrementado significativamente en los últimos años al ser una de las frutas que más exporta el país, su área cultivada ha venido reduciéndose desde 2009 debido al impacto negativo de diferentes enfermedades. Hasta el momento se conocía que el Cucumber mosaic virus (CMV), Soybean mosaic virus (SMV) y Cowpea aphid-borne mosaic virus (CABMV) eran los principales virus que afectaban este cultivo en Colombia. Con el fin de continuar caracterizando el viroma de la gulupa, en el presente estudio se realizó una secuenciación del transcriptoma de plantas cultivadas en el oriente de Antioquia. Con base en los resultados obtenidos para la secuenciación de nueva generación (NGS), se detectó un tymovirus infectando estas plantas. Los análisis filogenéticos indicaron que dicho virus está relacionado con: Passion fruit yellow mosaic virus (PFYMV), Cassia yellow mosaic-associated virus (CYMaV) y Calopogonium yellow vein virus (CYVV). La secuencia aquí reportada compartió niveles de identidad de 84,79% y 95,24% en nucleótidos y aminoácidos, con una secuencia de 1115 nt del segmento que comprende la region RdRP-CP del aislamiento PFYMV_Antioquia. Finalmente, mediante reacciones de RT-qPCR y secuenciación Sanger utilizando cebadores específicos, se confirmó la presencia del PFYMV en diferentes cultivos de gulupa de Antioquia. Este es el primer reporte de un genoma completo del PFYMV.

ABSTRACT Purple passion fruit (Passiflora edulis f. edulis), also known as gulupa, is a vine plant of the family Passifloraceae, which in recent years has gained importance in the world fruit market due to its exotic nature and excellent organoleptic properties. Although the demand for gulupa in Colombia has increased significantly to become one of the most important fruit exports, the cultivated area has been in decline since 2009 due to the impact of plant diseases. Cucumber mosaic virus (CMV), Soybean mosaic virus (SMV) and Cowpea aphid-borne mosaic virus (CABMV) are amongst the main viruses found infecting gulupa in Colombia. To further characterize the virome of gulupa, a deep sequencing transcriptome study was performed from a producing region in eastern Antioquia. Based on the results of next-generation sequencing (NGS), we report the genome sequence of a tymovirus infecting this plant. Phylogenetic analysis revealed this virus to be a close relative of Passion fruit yellow mosaic virus (PFYMV), Cassia yellow mosaic-associated virus (CYMaV) and Calopogonium yellow vein virus (CYVV). To date, only a 1,115 nt segment comprising the RdRp-CP region of PFYMV has been reported; this sequence shares 84.79% and 95.24% identities at the nucleotide and amino acid levels with isolate PFYMV_Antioquia. Finally, RT-qPCR and Sanger sequencing using specific primers confirmed the presence of PFYMV in different purple passion fruit crops in Antioquia. The present work is the first report of a complete genome sequence of PFYMV.

RESUMEN Los potyvirus son uno de los grupos de virus más limitantes en los cultivos de papa (Solanum tuberosum y S. phureja) en el mundo, siendo PVY, PVV y PVA las especies más prevalentes. En este trabajo se evaluó la presencia de estos potyvirus en cuatro lotes de S. tuberosum cv. Diacol-Capiro y cuatro lotes de S. phureja cv. Criolla-Colombia ubicados en el oriente de Antioquia, analizando la cápside viral mediante RT-PCR/secuenciación Sanger y secuenciación de nueva generación (NGS) para S. tuberosum. Los resultados indicaron la ocurrencia de los potyvirus PVY y PVV en las muestras de S. tuberosum y S. phureja, respectivamente; siendo detectadas mediante cebadores específicos la presencia de tres diferentes cepas de PVY (PVYN, PVYNTN y PVY°) en la región de estudio. Este hallazgo fue confirmado por NGS, obteniendo las secuencias completas de los genomas de estas tres cepas, lo que representa el primer reporte de PVYO en Colombia. Por su parte, los análisis de secuencias de la región CP de PVV indicaron niveles de identidad superiores a 99% con respecto a aislamientos del linaje PVVPhu reportado previamente en Antioquia. Estos hallazgos evidencian la necesidad de ajustar los sistemas de detección de virus en los programas de certificación de tubérculo-semilla de papa adelantados en el país.

ABSTRACT Potyviruses are one of the most limiting viruses for the potato (Solanum tuberosum and S. phureja) production worldwide, being PVY, PVV and PVA the most prevalent species. In this work, we tested the presence of these viruses in four commercial S. tuberosum cv. Diacol-Capiro and S. phureja cv. Criolla-Colombia plots in eastern Antioquia using RT-PCR and Sanger sequencing of the coat protein (CP) region, as well as next generation sequencing (NGS) for S. tuberosum samples. Our results revealed the presence of a PVV strain infecting S. phureja with high sequence identity (>99%) to lineage PVVPhu previously reported in Antioquia. Three strains of PVY (PVYN, PVYNTN and PVY°) were found to infect S. tuberosum. The presence of these three PVY strains was confirmed by NGS, allowing the assembly of their complete genomes. This is the first report of the full genome sequence of PVYo strain in Colombia. These findings highlight the need to adjust the tuber-seed certification programs currently implemented in the country.

El Potato yellow vein virus (PYVV) es uno de los virus más limitantes en cultivos de papa de la región andina. Es transmitido por moscas blancas y por tubérculos-semilla, por lo que la disponibilidad de métodos de detección resulta fundamental para su manejo. En este estudio se secuenció completamente el genoma de un aislamiento de PYVV de Solanum phureja en La Unión (Antioquia, Colombia), utilizando la secuenciación de nueva generación (NGS) y con base en dicha secuencia se diseñaron tres pares de cebadores para la detección del virus mediante RT-PCR convencional y RT-PCR en tiempo real (RT-qPCR). Estas pruebas fueron evaluadas en 12 muestras asintomáticas y en cuatro sintomáticas. El genoma del virus consistió en tres segmentos de ARN con tamaños de 8032, 5330 y 3891 nt y 10 marcos abiertos de lectura (ORF). Al comparar los niveles de identidad de los tres segmentos con aquellos del único genoma disponible en GenBank (PRJNA14924), se encontraron niveles superiores al 99,2 %. Los cebadores para la cápside (CP) permitieron la detección del PYVV por RT-qPCR en cinco de las muestras foliares asintomáticas (Ct=16,55-29,34; Tm=77,3-77,8 °C) y en las cuatro muestras con amarillamiento de venas. Los cebadores para RT-PCR convencional amplificaron los productos esperados de CP (496 pb) y de la cápside menor (793 pb) en las muestras sintomáticas, pero no en aquellas asintomáticas. Se sugiere el uso de RT-qPCR en programas de certificación de tubérculo-semilla de papa y de RT-PCR convencional para apoyar los análisis filogenéticos y de variabilidad molecular del virus.

Potato yellow vein virus (PYVV) is one of the most limiting viruses of potato crops in the Andean region. This virus is transmitted by whiteflies and infected tuber-seeds making the availability of adequate detection tools a very important need for management of the disease. In this study, the genome sequence of a PYVV isolate was obtained using the next generation sequencing (NGS) of infected leaves from a Solanum phureja plant in La Unión (Antioquia, Colombia) and, based on the genome data, three primer pairs for PYVV detection by RT-PCR and RT-qPCR were designed and tested in asymptomatic (12) and symptomatic (4) samples. The PYVV genome comprised three RNA segments of 8032, 5330 and 3891 nt containing a total of ten open reading frames. Comparison with the only PYVV genome sequence (PRJNA14924) available revealed an identity above 99.2 %. Primers targeting the coat (CP) sequence detected PYVV by RT-qPCR in five asymptomatic leaf samples (Ct=16.55-29.34; Tm=77.3-77.8 °C) and in the four samples showing vein-yellowing symptoms. Detection by RT-PCR resulted in fragments of the expected size for both the CP (496 bp) and the minor coat (793 bp) in symptomatic leaves. No amplification products were observed in asymptomatic material using these primers. We propose the use of RT-qPCR in tuber-seed certification programs and RT-PCR in phylogenetic and molecular variability studies of PYVV.

RESUMEN Potato yellow vein virus (PYVV), es uno de los fitopatógenos más limitantes para la producción de papa en la región de Los Andes. A pesar que se le ha detectado infectando tomate en Colombia, el conocimiento de las características biológicas de las cepas presentes en este hospedante es muy limitado. En este estudio, utilizando secuenciación masiva de nueva generación (NGS), se obtuvo la secuencia completa de los tres segmentos genómicos del PYVV en plantas de tomate en Marinilla (Antioquia) y se evalúo la utilidad de tres juegos de cebadores para su detección mediante pruebas de RT-PCR convencional y en tiempo real (RT-qPCR). El genoma de la secuencia consenso presentó tamaños de 8043 nt (ARN1), 5346 nt (ARN2) y 3896 nt (ARN3) y se identificaron los diez ORF previamente reportados en este virus, aunque, en general, éstos presentaron menores niveles de identidad que los registrados entre cepas de PYVV de papa. Análisis de variación y de selección identificaron dos regiones en los ORF MET/HEL y CPm que presentan selección positiva, lo que podría estar asociado a la adaptación por hospedante. Los tres juegos de cebadores amplificaron las regiones esperadas de la cápside de PYVV, siendo posible identificar, por diferencias en valores de temperatura de fusión (Tm) y por secuenciación Sanger, la ocurrencia de al menos dos variantes principales de este virus en el Oriente Antioqueño, lo que concuerda con los niveles moderados de polimorfismos encontrados en las secuencias obtenidas por NGS.

ABSTRACT Potato yellow vein virus (PYVV) is one of the most important pathogens of potato in the Andean region. In spite of having been detected in tomato crops in Colombia, knowledge on the biological characteristics of PYVV is limited on this host. In this study, next-generation sequencing (NGS) of a PYVV strain infecting tomato in Marinilla District (Antioquia) was performed; additionally, three primer set useful in RT-PCR and RT-qPCR detection were also tested. The consensus genome consisted of three RNA segments of 8043 nt (RNA1), 5346 nt (RNA2) and 3896 nt (RNA3) encoding ten ORF with slight lower sequence identity in relation to PYVV isolates from potato. Sequence analysis suggests the presence of regions potentially undergoing positive selection in the ORFs coding for MET/HEL and CPm possibly as a result of host adaptation. Experimental validation of primers resulted in amplicon with the expected size while melting temperature analysis and sequencing suggest the presence of at least two PYVV infecting S. lycopersicum in east Antioquia in agreement with the NGS data.

RESUMEN El análisis de transcriptomas de ají y pimentón en muestras obtenidas de cultivos comerciales en Santa Fe de Antioquia y El Peñol en el departamento de Antioquia, reveló la presencia de secuencias virales con similitud significativa con miembros del género Endornavirus. El ensamblaje de los transcriptomas arrojó secuencias consenso de 14.727 nt y 14.714 nt que fueron identificadas como los genomas de la especie viral Bell pepper endornavirus (BPEV), al compartir con ésta un 99,9% de identidad a nivel de nucleótidos y aminoácidos. La presencia de BPEV fue confirmada en diez muestras foliares de pimentón mediante pruebas de RT-qPCR, RT-PCR y secuenciación parcial de la región RdRp con cebadores específicos diseñados en este trabajo. La relación filogenética de ambas variantes de BPEV con otros miembros del género Endornavirus es analizada y discutida. Para nuestro conocimiento, este es el primer trabajo reportado sobre este grupo de virus en Colombia.

ABSTRACT Transcriptome analysis of chili and bell pepper samples from commercial plots in the municipalities of Santa Fe de Antioquia and El Peñol in the province of Antioquia revealed the presence of viral sequences with significant similarity to genomes of members of the genus Endornavirus. Assembly of the chili and bell pepper transcriptomes resulted in consensus sequences of 14,727 nt and 14,714 nt that were identified as Bell pepper endornavirus (BPEV). Both sequences were nearly identical by 99.9 % at both nucleotide and amino acid levels. The presence of BPEV was confirmed by RT-qPCR, RT-PCR and Sanger sequencing using RdRp-specific primers designed from the assembled sequences in ten independent random samples taken from the investigated bell pepper stands. The phylogenetic analysis of both BPEV variants and their affiliation within the genus Endornavirus is discussed. For our knowledge, this is the first study on this group of viruses in Colombia.

Las enfermedades virales son uno de los problemas más limitantes para la producción de papa en el mundo. Uno de los materiales de papa más susceptibles a los virus corresponde a Solanum phureja; sin embargo, en Colombia son pocos los estudios adelantados sobre los agentes causales que lo afectan. En este trabajo se realizó una caracterización molecular del Potato virus V (PVV) infectando plantas de S. phureja en Antioquia, utilizando métodos de secuenciación de nueva generación (NGS), pruebas de DAS-ELISA, RT-PCR en tiempo real (RT-qPCR) y RT-PCR convencional. Los resultados indican la ocurrencia de niveles muy variables de incidencia del virus entre lotes de cultivo (6,7 % a 86 %). El PVV tiene un genoma de 9828 nt que codifica para una poliproteína de 3066 aa y presenta dos variantes principales (Var_A y Var_B) en proporciones de 72 y 28 %. Estas variantes comparten altos niveles de identidad genética (99,7 % en todo el genoma) entre ellas y con respecto a la cepa PVV-Phureja reportada en Colombia, pero no con otras cepas del mundo (82-83 %). Con base en dichos genomas, se diseñaron y evaluaron en muestras foliares de S. phureja, dos pares de cebadores para la detección del virus en pruebas de RT-PCR (459 pb) y RT-qPCR (89 pb, Ct=12,08-21,86 y Tm= 78,7°C-80,2 °C), confirmándose la presencia de este virus en tejidos sintomáticos y asintomáticos de papa criolla. La ocurrencia generalizada de PVV en los cultivos de S. phureja indica la necesidad de incorporar en los programas de certificación de tubérculos-semilla de S. phureja en Colombia el diagnóstico de este virus.

Viral diseases are one of the most limiting problems in the production of potato worldwide. Solanum phureja constitutes one of the most susceptible materials to viral diseases in Colombia; however, there are few studies on viruses infecting this crop. In the current study, we performed a molecular characterization of Potato virus V (PVV) that infects S. phureja, using different potato plots located in the province of Antioquia, using Next-Generation Sequencing (NGS), DAS-ELISA, real time RT-PCR (RT-qPCR) and RT-PCR. Results revealed variable levels of incidence among plots (6.7 %-86 %) and the presence of two slightly different variants (Var_A and Var_B) present in approximately 72 %:28 % ratio. These PVV strains have a genome of 9828 nt codifying for a polyprotein of 3066 aa and share high nucleotide sequence identity (99,7 % in their complete genome) with respect to PVV-Phureja, recently described in Colombia, but are very divergent with respect to currently available PVV genomes (82-83 %). The genome information was used to design two sets of primers, useful in the specific detection of this virus in S. phureja leaf samples through RT-PCR (459 bp) and RT-qPCR (89 bp, Ct=12.08-21.86; Tm=78.7 °C-80.2 °C). This study underscores the importance of including diagnostics of PVV in S. phureja tuber-seed certification programs in Colombia.

El Potato virus Y (PVY) es uno de los virus más limitantes en cultivos de solanáceas. En la región andina es frecuente encontrar cultivos mixtos de estas especies vegetales, lo cual facilita la inoculación cruzada con este virus. Estudios recientes en el departamento de Antioquia, Colombia, han detectado altos niveles de incidencia y variación genética de PVY en papa y tomate de árbol. Con el fin de evaluar si esta situación también ocurre en los cultivos de tomate de esta región, se realizó una secuenciación de nueva generación (NGS) del transcriptoma de tejido foliar de tomate, como base para la caracterización molecular del PVY en este hospedero. Se determinó, además, su incidencia en tres lotes de cultivo con TAS-ELISA y se confirmó su presencia por RT-PCR en tiempo real (RT-qPCR). El PVY fue detectado en el 13,3% de las 45 muestras foliares analizadas mediante TAS-ELISA y se confirmó por RT-qPCR con valores de ciclo umbral (Ct) de 14,31 a 33,8 y temperaturas de fusión (Tm) de 77,5 ± 1,5 °C. Los análisis bioinformáticos identificaron la ocurrencia de dos variantes de PVY en proporciones de 3:2. Sus genomas tienen un tamaño de 9726 nt y comparten 97,5 % de identidad; codifican para una poliproteína de 3061 aminoácidos, con regiones no traducidas (UTR) 5’ y 3’ de 218 y 325 nt, respectivamente. Los análisis filogenéticos, tanto de la poliproteína como de la cápside de ambas variantes, indican su afinidad con genotipos de PVY NTN, y constituyen el primer reporte en América del genoma completo de este virus en el cultivo de tomate.

PVY is one of the most limiting viruses in solanaceous plants. These crops are frequently planted together facilitating their cross-inoculation with this virus. Recent studies in Antioquia, Colombia, detected high levels of incidence and genetic variability of PVY infecting potato and tamarillo. In this study, Next-Generation Sequencing (NGS) transcriptome analysis of tomato leaves was used to confirm the presence of PVY in tomato crops in that region; virus incidence was evaluated in three plots using TAS-ELISA and further confirmed by real-time RT-PCR (RT-qPCR). TAS-ELISA of 45 leaf samples detected PVY in 13.3 % of them; RT-qPCR confirmed the serological results with threshold cycle values in the 14.31 and 33.8 range and a Tm of 77.5 ± 1.5 °C. Bioinformatic analysis confirmed the presence of two PVY variants (proportion 3:2), sharing 97.5 % of sequence identity. Both genomes are 9726 nt in size and code for 3061 amino acids polyprotein flanked by 5´and 3´ untranslated regions (UTR) of 218 and 325 nt. Phylogenetic analysis of both the sequences coding for the coat protein and the complete polyprotein suggest phylogenetic affinity with PVY NTN. To our knowledge, this is the first American report of a complete PVY genome naturally infecting tomato.

The aim of this work was to evaluate the techniques TAS-ELISA and IC-RT-qPCR as detection tools for Potato virus Y (PVY) in foliar tissues of potato (Solanum tuberosum L.). Leaf samples of the potato variety Diacol-Capiro from three different plots in northern Antioquia (Colombia) were used. Additionally, the complete genome sequence of this virus was obtained using Next-generation sequencing (NGS). PVY detection using both techniques differed significantly in sensitivity, as 88.8% of the samples tested positive for PVY using IC-RT-qPCR in contrast to only 33.3% with TAS-ELISA. Sanger sequencing of the RT-qPCR amplicons and the comparison with the melting temperatures of the positive control (77.5°C±1°C) were used to confirm the presence of PVY. Bioinformatics analysis resulted in a contig of 9701 nt with an average sequence depth of 716x. The PVY_Yarumal contains an ORF coding for a 3061 residue protein flanked by 5' and 3' untranslated regions of 187 and 328 nt, respectively. Phylogenetic analysis using the complete polyprotein CDS and CP regions suggests phylogenetic identity with necrotic strain PVY NTN; sequence motifs K400E419and QELA typical of PVY NTN were also found in PVY_Yarumal. These results suggest that urgent measures are required to strengthen current integrated virus disease management in the potato agroindustry in Colombia by using highly sensitive detection techniques based on real-time RT-PCR.

El objetivo de este trabajo fue evaluar las técnicas de detección del Potato virus Y (PVY):TAS-ELISA e Inmunocaptura-RT-PCR en tiempo real (IC-RT-qPCR), en tejidos foliares de papa (Solanum tuberosum L.) cv. Diacol-Capiro procedentes de tres lotes del Norte de Antioquia, Colombia. Adicionalmente, se secuenció el genoma de este virus mediante secuenciación masiva de nueva generación (NGS). Se detectó el PVY con ambas técnicas en los tres lotes, aunque estas difirieron significativamente en su sensibilidad; con IC-RT-qPCR se encontró el virus en el 88,8% de las muestras, mientras que con TAS-ELISA en el 33,3%. La naturaleza de los amplicones se confirmó por secuenciación Sanger (identidad=98-100%) y comparación con los valores de temperaturas de fusión (Tm) del control positivo (77,5°C±1°C). Los análisis bioinformáticos permitieron caracterizar el genoma completo de la cepa PVY_Yarumal, con una profundidad de 716x y un tamaño de 9701nt. Presenta un marco de lectura abierto (ORF) que codifica para una poliproteína de 3061 aminoácidos, flanqueada por regiones no traducidas (UTR) 5' y 3' de 187 y 328nt, respectivamente. Los análisis filogenéticos, tanto de la poliproteína completa como de la secuencia de la cápside, indican su identidad con genotipos de la raza necrosante PVY NTN; se identificaron, además, los motivos K400E419 y QELA asociados a dicho linaje. Estos resultados plantean la necesidad de incorporar en los programas de manejo de enfermedades virales, en la agroindustria de papa en Colombia, el empleo de técnicas de detección altamente sensibles como las basadas en RT-PCR en tiempo real.

Las virosis son uno de los problemas fitosanitarios más limitantes para la producción de papa, siendo los virus Potato leafroll virus (PLRV), Potato virus Y (PVY), Potato virus S (PVS) y Potato yellow vein virus (PYVV) los que generan mayores pérdidas económicas en la región andina. Generalmente estos virus son transmitidos por insectos hemípteros y por tubérculos-semilla. En esta investigación se evaluó la presencia y distribución del PLRV en tubérculos de Solanum tuberosum variedad Diacol-Capiro y S. phureja variedad Criolla-Colombia obtenidos en Antioquia, utilizando pruebas serológicas y moleculares. Mediante DAS-ELISA se evaluaron 128 muestras consistentes en tres tipos de tejidos (piel, yemas latentes y brotes), mientras que con RT-PCR en tiempo real (RT-qPCR), se utilizó un subgrupo de 12 muestras de cada variedad. Utilizando DAS-ELISA, el PLRV se encontró en el 3,1% y 10,1% de las muestras de Diacol-Capiro y Criolla-Colombia, respectivamente; siendo evidente una mayor detección del virus en la piel de los tubérculos de ésta última variedad. Las pruebas de RT-qPCR detectaron el PLRV en 83,3% y 91,6% de las 12 muestras de Diacol-Capiro y de Criolla-Colombia, respectivamente; con valores de Ciclo umbral (CT) entre 17,72 y 30,59. La naturaleza de los amplicones obtenidos por RT-qPCR fue confirmada por secuenciación como parte de una región codificante de la cápside del PLRV (Identidad=99%-100%). Estos resultados enfatizan en la necesidad de utilizar tubérculo-semilla certificados por su sanidad viral en los cultivos de papa del país y de fortalecer dichos programas a partir del empleo de técnicas de detección altamente sensibles como RT-qPCR

Viral diseases are one of the most limiting phytosanitary problems in the production of potato with Potato leafroll virus (PLRV), Potato virus Y (PVY), Potato virus S (PVS) and Potato yellow vein virus (PYVV) having the biggest economic impact in crops of the Andean region. These viruses are transmitted by hemipteran insects and tubers. In this work, the presence and distribution of PLRV in Solanum tuberosum v. Diacol-Capiro and S. phureja v. Criolla-Colombia tubers was investigated using serological and molecular tests. 128 samples from three types of tissues (skin, dormant buds and sprouts) were tested using DAS-ELISA while a 12-sample subset from each variety was used for real time RT-PCR (RT-qPCR). With DAS-ELISA, PLRV was detected in 3,1% and 10,1% of Diacol-Capiro and Criolla-Colombia samples, respectively; in the latter, PLRV was detected mostly in the tuber skin. PLRV was detected in 83,3% and 91,6% of Diacol-Capiro and Criolla-Colombia samples, respectively, using RT-qPCR. Threshold cycles (Ct) were in the 17,72 to 30,59 range. Sequencing of RT-qPCR fragments resulted in 99-100% nucleotide identity with respect to the PLRV coat protein. These results highlight the need of using certified tuber-seed in potato crops in Colombia and strengthening the seed certification programs using highly sensitive techniques such as RT-qPCR

El Potato virus X (PVX) es uno de los virus más limitantes del cultivo de la papa en el mundo. Es transmitido solamente por contacto y por tubérculo-semilla. Su control se fundamenta en la siembra de tubérculos certificados por su sanidad viral y en la disponibilidad de metodologías de diagnóstico altamente sensibles. En este trabajo se evaluó la prevalencia del PVX en cuatro diferentes tejidos de tubérculos de Solanum tuberosum subsp. andigena var. Diacol-Capiro y S. phureja var. Criolla Colombia utilizando pruebas de DAS-ELISA para 128 submuestras y de RT-qPCR para 32 grupos de submuestras (4 submuestras/grupo). Los resultados de las pruebas serológicas indicaron la presencia de PVX en el 6,25 y 50% de las submuestras analizadas para la variedad Diacol-Capiro y Criolla Colombia, respectivamente; mientras que los niveles de prevalencia del PVX utilizando la detección por RT-qPCR fueron del 93,75%, independientemente de la variedad de papa y del tejido evaluado. Los valores promedio del ciclo umbral (Ct) en las RT-qPCR fueron de 25,6 (Ct=18,02 a 34,49) y el análisis de las curvas de desnaturalización permitió identificar dos variantes del virus con valores de Tm de 79,5±1°C y 83,7±1°C. La secuenciación de los amplicones obtenidos por RT-qPCR para los controles positivos y para dos de las muestras, confirmó su naturaleza viral. Estos resultados señalan unos muy altos niveles de prevalencia de PVX en el material de siembra de papa en Antioquia y la necesidad de fortalecer los programas de certificación de semilla con pruebas de detección como RT-qPCR.

Potato virus X (PVX) is one of the most important virus affecting potato crops worldwide. The virus is only transmitted mechanically and through tuber-seeds. Control of PVX is based on the usage of certified tubers, which in turn depends on the availability of sensitive diagnostic tests that allow its direct detection on seeds. In this work, the prevalence of PVX in four different tuber tissues of Solanum tuberosum subsp. andigena var. Diacol-Capiro and S. phureja var. Criolla was evaluated using DAS-ELISA (128 subsamples) and RT-qPCR (4 subsamples per group). DAS-ELISA revealed the presence of PVX in 6.25 and 50% of Diacol-Capiro and Criolla Colombia subsamples; in contrast, RT-qPCR detected PVX in 93.75% of the samples independent of the potato variety or type of tissue. Ct values were in the 18.02 to 34.49 range with a mean value of 25.6. Melting curve analysis allowed the identification of two virus variants with Tm values of 79.5±1°C and 83.7±1°C. Sanger sequencing of the positive controls and two of the samples confirmed RT-qPCR amplicons to be PVX. These results reveal a high level of prevalence of PVX in potato tuber seeds used in Antioquia and the need to strengthen seed certification programs in Colombia through RT-qPCR detection assays.

En este estudio se determinaron las relaciones filogenéticas y los niveles de variación de aislamientos de PVX obtenidos en tejidos foliares de plantas de Solanum tuberosum subsp. andigena var. Diacol-Capiro y S. phureja var. Criolla Colombia en Antioquia, utilizando métodos de secuenciación de nueva generación (NGS) y de Sanger. Inicialmente, se detectó el PVX mediante DAS-ELISA (Agdia-PSA10000), confirmándose su presencia en ocho de las muestras por Inmunocaptura-RT-PCR en tiempo real (IC-RT-qPCR). Los resultados de las pruebas serológicas indicaron la infección de PVX en 14,7 % y 13,3 % de las muestras de Diacol-Capiro y Criolla Colombia, respectivamente. Su identidad fue confirmada por IC-RT-qPCR, con valores de ciclo umbral (Ct) de 15,04 a 27,59 y dos temperaturas de fusión (Tm) (Tm1 = 80,3 °C ± 0,5 y Tm2 = 83,3 °C ± 0,5), encontrándose así dos variantes de PVX en Antioquia. Utilizando NGS se detectó el PVX en bajos niveles de infección en las muestras de Criolla Colombia, siendo posible obtener contigs parciales para todos los ORFs del genoma viral. Con NGS no se detectó el virus en las muestras de Diacol-Capiro evaluadas. Los análisis filogenéticos realizados con base en secuencias de cápside y replicasa viral separaron los aislamientos de PVX de Antioquia en dos grupos, relacionados con el clado Eurasiático (I) de este virus. Los altos niveles de infección de PVX detectados en los cultivos de papa de Antioquia y la ocurrencia de al menos dos variantes, enfatizan en la necesidad de fortalecer los programas de certificación de tubérculos-semilla de papa, como principal herramienta para el control de este virus.

In this study, the phylogenetic relationships and molecular variability of PVX isolates from leaf samples of Solanum tuberosum subsp. andigena var. Diacol-Capiro and S. phureja var. Criolla Colombia in Antioquia were analyzed. Sequences were obtained using Next Generation Sequencing (NGS) of bulk samples and Sanger sequencing. DAS-ELISA (Agdia-PSA10000) revealed infection levels of 14.7 % and 13.3 % leaf samples of Diacol-Capiro and Criolla Colombia, respectively. The presence of PVX was further confirmed by IC-RT-qPCR in eight samples, which resulted in Ct values in the 15.04-27.59 range and two melting temperatures (Tm1 = 80.3 °C ± 0.5 and Tm2 = 83.3 °C ± 0.5). These results suggest the presence of at least two PVX variants in Antioquia. Using NGS, PVX was detected at low levels in leaf samples of Criolla Colombia, which resulted in contigs for most ORFs of the viral genome; NGS did not detect PVX in Diacol-Capiro samples. Phylogenetic analysis using capsid and replicase sequences separated PVX isolates into two groups within the Eurasian class (I). The high levels of PVX infection detected in potato crops in Antioquia and the presence of at least two variants highlight the need to strenghten current tuber seed certification programs aimed at controlling the spread of this virus.