O objetivo deste trabalho foi comparar a eficiência da solubilização de quatro detergentes comercialmente disponíveis, ASB 14, SB 3-10, CHAPS e Triton X100, na extração de proteínas de membrana da bactéria Xylella fastidiosa para estudos proteômicos. Estas proteínas foram solubilizadas em duas etapas em tampões diferenciados pelos detergentes e submetidas à eletroforese bidimensional (2-DE) em uma faixa de pH não linear de 3-10. Os detergentes ASB 14 e SB 3-10 foram os mais efecientes, revelando 221 e 157 proteínas, respectivamente, enquanto que o CHAPS e o Triton X100 resultaram somente 72 e 43 proteínas, respectivamente. A identificação das proteínas foi feita por 'peptide mass fingerprinting' em espectrometria de massa MALDI-TOF, através de peptídeos obtidos por digestão com tripsina in gel. Os 18 spots de proteínas do gel com tratamento com ASB 14 mostrou que 83% eram proteínas de membrana. Este estudo concluiu que o detergente ASB-14 foi o mais eficiente na solubilização de proteínas de membrana de Xylella fastidiosa.

Four different detergents, ASB 14, SB 3-10, CHAPS and Triton X100, were utilized to determine the optimal detergent for the solubilization of membrane proteins from the phytopathogenic bacterium Xylella fastidiosa. These proteins were differentially solubilized in distinct buffers containing the detergent and subjected to bidimensional electrophoresis within the non-linear pH range of 3-10. The detergents ASB 14 and SB 3-10 were the most effective revealing 221 and 157 spots, respectively. CHAPS and Triton X100 were less effective and revealed only 72 and 43 spots, respectively. MALDI-TOF tryptic peptide mass fingerprinting of 18 excised proteins from the ASB 14 treatment revealed that 83% were membrane proteins and that the theoretical efficiency of solubilization for ASB 14 was estimated to be 87%. This study demonstrates the effectiveness of the detergent ASB 14 for the solubilization of membrane proteins from the bacterium X. fastidiosa.

Estudos in vitro foram desenvolvidos para obter proteínas de Xylella fastidiosa expressas diferencialmente na presença de calos do hospedeiro, citros cultivar Pêra. Para otimizar a indução, desenvolveu-se um meio de cultura comum, o qual foi baseado na seiva do xilema de citros, para cultivar a bacteria e os calos de Pêra. Dados mostraram, após 72 h de cultivo neste meio, 10(8) unidades formadoras de colônias de X. fastidiosa por mL, e 0,79 g de peso seco de células de Pêra. Após testar diferentes métodos de co-cultivo da bactéria com calos de Pêra neste meio, observou-se que a melhor taxa de indução ocorreu quando X. fastidiosa foi cultivada em meio sólido enriquecido com um extrato derivado dos calos de Pêra. Análise em gel bidimensional (2DE) de X. fastidiosa (120 µg) cultivadas na presença do extrato revelou 414 proteínas expressas diferencialmente quando comparado com o perfil proteico obtido na ausência do extrato.

An in vitro system was developed to induce and identify Xylella fastidiosa proteins that were differentially expressed in the presence of callus-derived extracts from its host, the citrus cultivar Pêra. To optimize the induction, we first developed a single culture medium for the growth of both, host and bacteria. This medium, CPXPm7, which mimics the citrus xylem sap, showed that X. fastidiosa at 72 h post-incubation had 10(8) colony forming units mL-1, while Pêra cells had the highest fresh weight content (0.79 g). After testing various methods of co-cultivation of the bacteria and host callus grown in this single medium, the best induction procedure was to grow X. fastidiosa in a solid medium amended with an extract of Pêra callus grown in CPXPm7. Analysis, by two-dimensional electrophoresis, of the X. fastidiosa proteins (120 µg of total proteins) grown in the presence of Pêra callus extract revealed 414 differentially expressed protein spots when compared to the protein profile obtained in the absence of the extract. The system developed in this study improves the induction and analysis of differentially expressed proteins of X. fastidiosa, which may be involved in pathogenicity.

A diversidade genética de 18 isolados de Rhizoctonia solani de feijoeiro (Phaseolus vulgaris) cultivado na Mata Atlântica de São Paulo, Brasil foi avaliada através da análise do espaçadores transcritos internos (ITS), microssatélites e iniciadores ("primers") específicos para sequências teloméricas. A análise de restrição da região ribossomal ITS1/5,8S/ITS2 produziu um padrão de bandas específico para o grupo de anastomose 4 (GA 4) e seus subgrupos. O padrão obtido com ITS/RFLP, microsatélites e os iniciadores teloméricos permitiram identificar cinco a 11 genótipos entre os isolados de R. solani. Enquanto todos os isolados foram patogênicos em feijoeiro, não houve correlação entre patogenicidade e diferenças genotípicas. Os diferentes iniciadores para PCR revelaram que muitos isolados são geneticamente similares, análise esta que pode ser confirmada por mais de um conjunto de iniciadores, fortalecendo a relação deste agrupamento.

Rhizoctonia solani isolates obtained from common beans (Phaseolus vulgaris) grown in the mountainous Atlantic Rainforest (Mata Atlântica) region of São Paulo, Brazil, were analyzed to determine their genetic diversity using internal transcribed spacer (ITS), microsatellite and telomere sequence-based PCR primers. Restriction digestion of the ITS1/5.8S/ITS2 ribosomal regions yielded unique banding patterns specific for AG4 and its subgroups. The ITS restriction digestion (ITS/RFLP), telomere and microsatellite primers identified five to 11 genotypes within the isolates of R. solani. While all isolates were pathogenic on beans, there was no correlation found between genotypic differences and pathogenicity. The different PCR primers revealed a number of isolates that were genetically similar. Some of these genetic groups were supported by more than one of the primers utilized in this study, thus confirming their relationship.

Sclerotinia sclerotiorum, o agente causal do mofo branco, causa danos severos na cultura do feijoeiro (Phaseolus vulgaris) na época do inverno em regiões brasileiras que são irrigadas com pivô central. Isolados de S. sclerotiorum foram obtidos de uma área sob pivô central perto de Guaíra-SP, Brasil. Estudos sobre o grupo de compatibilidade micelial (GCM) desses isolados revelaram a presença de dois GCM. Análises de PCR/RFLP, com iniciadores conhecidos das regiões ITS1-5.8S-ITS2 não mostraram diferenças genética entre os isolados. Entretanto, diversidade genética entre isolados pertencentes ao mesmo GCM pôde ser observada através da amplificação da região cromossomal com iniciadores baseados na sequência do telômero e um microsatélite. Os mesmos GCM e perfil de bandas obtido com os iniciadores teloméricos também foram observados em S. sclerotiorum isolados de diferentes culturas de outras regiões brasileiras. Os resultados obtidos comprovam que as sequências do telômero podem ser usadas para revelar diferenças genotípicas entre isolados de S. sclerotiorum.

Sclerotinia sclerotiorum, the causal agent of white mold, is a problem of winter bean (Phaseolus vulgaris) production in Brazil under center-pivot irrigation. Isolates of S. sclerotiorum were obtained from a center-pivot-irrigated field near Guaíra-SP, Brazil. Mycelial compatibility group (MCG) studies revealed the presence of only two MCG. PCR/RFLP analysis of the ITS1-5.8S-ITS2 ribosomal subunit regions of these field isolates of S. sclerotiorum failed to show any genetic differences between these two MCGs. DNA amplification with a chromosomal telomere sequence-based primer and one microsatellite primer revealed genetic polymorphisms among isolates within the same MCG. Isolates taken from beans and two other crops from another region of Brazil showed the same two MCG and had identical banding patterns for the telomere and microsatellite primers. These findings support the use of telomere sequence-based primers for revealing genotypic differences among S. sclerotiorum isolates.