Abstract Background: Argenteohyla siemersi (red-spotted Argentina frog) is a casque-headed tree frog species belonging to the Hylidae family. This species has a complex combination of anti-predator defense mechanisms that include a highly lethal skin secretion. However, biochemical composition and biological effects of this secretion have not yet been studied. Methods: The A. siemersi skin secretion samples were analyzed by mass spectrometry and chromatographic analysis (MALDI-TOF/MS, RP-HPLC and GC-MS). Proteins were also studied by SDS-PAGE. Among the biological activities evaluated, several enzymatic activities (hemolytic, phospholipase A2, clotting, proteolytic and amidolytic) were assessed. Furthermore, the cytotoxic activity (cytolysis and fluorescence staining) was evaluated on myoblasts of the C2C12 cell line. Results: The MALDI-TOF/MS analysis identified polypeptides and proteins in the aqueous solution of A. siemersi skin secretion. SDS-PAGE revealed the presence of proteins with molecular masses from 15 to 55 kDa. Steroids, but no alkaloids or peptides (less than 5 KDa), were detected using mass spectrometry. Skin secretion revealed the presence of lipids in methanolic extract, as analyzed by CG-MS. This secretion showed hemolytic and phospholipase A2 activities, but was devoid of amidolytic, proteolytic or clotting activities. Moreover, dose-dependent cytotoxicity in cultured C2C12 myoblasts of the skin secretion was demonstrated. Morphological analysis, quantification of lactate dehydrogenase release and fluorescence staining indicated that the cell death triggered by this secretion involved necrosis. Conclusions: Results presented herein evidence the biochemical composition and biological effects of A. siemersi skin secretion and contribute to the knowledge on the defense mechanisms of casque-headed frogs.

The thermal decomposition reaction of acetone cyclic diperoxide (ACDP) in 1-octanol (OCT) solution, at the temperatures and initial concentration ranges of 130° - 166 ºC and (0.94-3.00) x 10-2 mol/L , respectively, follows a pseudo-first order kinetic law. Acetone is the main organic decomposition product observed. The activation parameters values of the initial reaction step (DH# = 25.8 ± 0.3 kcal/mol; DS# = -19.1 ± 0.6 cal/mol K; Ea = 26.6 ± 0.3 kcal/mol), support a reaction mechanism which includes a homolytic rupture of one peroxidic bond of the ACDP molecule with participation of the solvent and involving a biradical intermediate.

La reacción de descomposición térmica del diperóxido de acetona cíclico (ACDP) en solución de 1-octanol (OCT), en los rangos de temperatura y concentraciones iniciales de 130° - 166 ºC y (0.94-3.00) x 10-2 mol/L respectivamente, sigue una ley cinética de seudo primer orden. La acetona es el principal producto de descomposición observado. Los valores de activación de la etapa inicial (DH# = 25.8 ± 0.3 kcal/mol; DS# = -19.1 ± 0.6 cal/mol K; Ea = 26.6 ± 0.3 kcal/mol) apoyan un mecanismo de reacción que incluye una ruptura homolítica de un enlace peroxídico en la molécula del ACDP con participación del solvente y que involucra un birradical intermediario.

Crotalus durissus terrificus (C.d.t.) (South American rattlesnake) venom possesses myotoxic and neurotoxic activities, both of which are also expressed by crotoxin, the principal toxin of this venom. Crotoxin contains a basic phospholipase A2 (PLA2) and a non toxic acidic protein, crotapotin. We have produced and investigated the ability of IgG antibodies raised in rabbits against PLA2 to neutralize the lethality of the whole venom. PLA2 was isolated by gel filtration chromatography (Sephadex G-75). Specific antibodies were obtained by subcutaneous and intramuscular inoculation of PLA2 (700 µg) with Freund adjuvant. Groups of six mice (20 + 2 g) were inoculated with 0.5 ml i.p. of C. d. t. venom (4 µg) or a mixture of venom that had been preincubated with the desired volume of IgG antibodies. Mortality, recorded 24 and 48 h after inoculation, showed that IgG anti-PLA2 were more effective than anticrotalic serum in neutralizing the lethal activity. These results demonstrate that it could be possible to obtain an anti-venom made by specific antibodies with a high level of protection against the lethal component of C.d.t. venom, and/or the inclusion of these antibodies as a supplement in heterologous anti-venoms.

El veneno de Crotalus durissus terrificus (C.d.t.) (Cascabel de Sud América) posee actividad miotóxica y neurotóxica, actividades que también exhibe el complejo crotoxina, principal componente tóxico de este veneno. El complejo crotoxina está constituido por una fosfolipasa A2 básica (PLA2) y una proteína acídica no tóxica, el crotapotín. En este trabajo se estudió la capacidad neutralizante de anticuerpos IgG anti-PLA2 sobre la letalidad inducida por el veneno entero. El antígeno PLA2, fue aislado por cromatografía de filtración en gel (Sephadex G-75). Se inocularon conejos machos por vía subcutánea e intramuscular, con 700 µg de PLA2 y adyuvante para la obtención de anticuerpos específicos. La capacidad neutralizante del antisuero se analizó en ratones por inoculación con diluciones de veneno entero preincubado con un volumen adecuado de anticuerpos IgG anti-PLA2. Se inocularon ratones controles con 0.5 ml i.p. de veneno (4 µg.ml-1). El número de muertes fue contabilizado a las 24 y 48 h posteriores a la inoculación, demostrándose que la capacidad neutralizante de los anticuerpos IgG anti-PLA2 fue superior a la obtenida con el antiveneno crotálico. Los resultados obtenidos demuestran la potencial aplicación de antivenenos constituidos por anticuerpos específicos contra PLA2, y/o la inclusión de estos anticuerpos como suplementos en antivenenos polivalentes.

Due to variability of venom components from the same species of snakes that inhabit different regions, particular properties of the venom of Crotalus durissus terrificus that inhabits the North-East of Argentina were studied. Gyroxin, a thrombin-like enzyme, was isolated from this venom by gel filtration and affinity chromatography, it was found to be homogeneous according to SDS-PAGE, with a molecular weight of 33 kDa. "Gyroxin syndrome" in mice was tested and it showed changes in the animal behavior, confirming that the isolated thrombin-like enzyme is gyroxin. Effects of this enzyme and the crude venom on mice plasmatic fibrinogen levels were determined. The mice plasma fibrinogen decreased rapidly until incoagulability during the first hour after thrombin-Iike enzyme injection, then reaching its normal level 10 hours after injection; whereas crude venom resulted in a 60% decrease of the mice plasma fibrinogen, reaching its normal level after the same period of time. After 1 hour of gyroxin inoculation, intravascular coagulation was observed in histological cuttings of lung, cardiac muscle and liver. The isolated enzyme showed strong hydrolyzing activity on fibrinogen and fibrin in vitro, whereas the crude venom exhibited weak hydrolyzing activity on both substrates. It is probable that this very low activity is due to the low percentage of the enzyme in the crude venom. Decreasing of plasmatic fibrinogen levels may be due to either the coagulant or hydrolyzing actions of the enzyme.

Teniendo en cuenta la variabilidad de los componentes del veneno de serpientes de una misma especie que habitan regiones diferentes, se decidió estudiar las propiedades particulares del veneno de Crotalus durissus terrificus que habita el nordeste de Argentina, Giroxina, una enzima con actividad trombínica, fue aislada del veneno por cromatografía de filtración por gel y de afinidad; se comprobó su homogeneidad y se determinó su peso molecular, 33 kDa, por SDS-PAGE. Se ensayó el síndrome giroxina en ratones, los que mostraron cambios en el comportamiento, confirmando que la enzima tipo trombina aislada es giroxina. Se evaluó la acción de esta enzima sobre los niveles de fibrinógeno plasmático en ratones, comparándola con la del veneno crudo. Se comprobó que la enzima provoca una disminución de los niveles plasmáticos de fibrinógeno hasta la incoagulabilidad, durante la primer hora de inoculación, mientras que el veneno entero produjo una reducción del nivel plasmático en un 60%; sin embargo, en ambos casos, se evidenció una rápida reposición de fibrinógeno plasmático, alcanzando sus valores normales en un plazo de 10 horas. Se observó coagulación intravascular con la administración de giroxina una hora después de la inoculación, evidenciados en estudios histológicos de tejido pulmonar, cardíaco y hepático. En ensayos realizados in vitro, la enzima aislada mostró capacidad de degradar fibrinógeno como así también coágulos de fibrina, mientras que el veneno exhibió débil actividad hidrolítica sobre ambos sustratos. Es probable que esta baja actividad sea debida a la baja concentración de la enzima en el veneno. La disminución de los niveles de fibrinógeno plasmático observado en ratones se debería a la acción coagulante de la enzima, sin embargo no se descarta que también contribuya a este proceso una acción hidrolítica sobre fibrinógeno y fibrina por parte de la enzima.

The 3,3,6,6-tetramethyl-1,2,4,5-tetroxane (ACDP) in methanol solution shows an absorbance peak at low wave length in UV spectrum and follows the Lambert Beer law until 10-2 M concentration at 209 nm. The ACDP thermal decomposition have been studied by the UV spectroscopy like an alternative method to find out the kinetic parameters from the thermolysis of these compounds. The rate constants at the temperatures and initial concentration ranges of 130-166 ºC and 0,003-0,013 mol / L, respectively, and the activation parameters were similar to the corresponding values found by other methodology, verifying this analytic technique. Acetone produced during reaction no interference in ACDP cuantification by UV analysis.

El 3,3,6,6-tetrametil-1,2,4,5-tetroxano (ACDP) en solución de metanol presenta un pico de absorbancia a bajas longitudes de onda presentando lecturas estables y cumpliendo la Ley de Lambert Beer a 209 nm, hasta concentraciones del orden de 10-2 M. Se estudió la cinética de descomposición térmica de este diperóxido cíclico en metanol por espectroscopía UV, como metodología alternativa para la determinación de parámetros cinéticos que rigen la reacción de termólisis de este tipo de compuestos. Los constantes de velocidad obtenidas en el intervalo de temperaturas 130,0-166,0 °C, y de concentaciones iniciales de 0,003-0,013 mol / L y los parámetros de activación calculados fueron comparables con los obtenidos en estudios realizados por otra metodología, demostrando la validez del método. La acetona producida en la termólisis no interfiere en la cuantificación de ACDP remanente.