RESUMO Neospora caninum é o principal agente etiológico da neosporose em animais domésticos, e sua patogênese compreende duas fases características: aguda e crônica. Roedores são usados como modelos experimentais para simular neosporose bovina aguda e crônica. Neste estudo, foi inoculado um total de 27 gerbilos, fêmeas, com diferentes doses de taquizoítos de N. caninum, visando induzir doença crônica. O DNA foi extraído de diferentes órgãos de cada animal após a morte espontânea ou a eutanásia. Os tecidos encefálicos foram submetidos à PCR em tempo real de alta sensibilidade para detecção de animais com infecção crônica. Todas as outras amostras foram submetidas à PCR padrão. Um total de 11 gerbilos morreu devido à neosporose aguda, como confirmado pela detecção de DNA de N. caninum nos órgãos. A dosagem de antígeno que pode induzir infecção crônica foi de 5x103 taquizoítos/mL de N. caninum. Em seções do encéfalo de alguns animais, que apresentaram sinais clínicos de infecção persistente, encontraram-se 70% de positividade para a seção do encéfalo anterior, sugerindo essa área como preferencial para a formação de cisto. Assim, foram determinadas,, em gerbilos, as dosagens de taquizoítos capazes de induzir infecção crônica ou aguda, bem como foram detectados tecidos positivos, preferencialmente, em órgãos sistêmicos, na fase aguda, e no encéfalo, na crônica.

ABSTRACT Neospora caninum is the main etiologic agent of neosporosis in domestic animals and its pathogenesis comprises two characteristic phases: acute and chronic. Rodents are used as experimental models to mimic acute and chronic bovine neosporosis. In this study, we inoculated a total of 27 female gerbils, with different doses of N. caninum tachyzoites aiming to induce chronic disease. DNA was extracted from different organs of each animal after spontaneous death or euthanasia. Encephalic tissues were submitted to a highly sensitive real time PCR aiming to detect chronically infected animals. All the other samples were submitted to standard PCR. A total of 11 gerbils died due to acute neosporosis, as confirmed by N. caninum DNA detection in organs. 5x103 tachyzoites/mL of N. caninum was the dosage of antigen that can induce chronic infection in gerbils. In the encephalon sections of some animals that showed clinical signs of persistent infection, we found 70% positive for the anterior encephalon section, suggesting this area as preferential for cyst formation. Therefore, we determined the doses of tachyzoites that cause acute or chronic infection and detection of positive tissues, preferably, systemic organs during acute and encephalon in chronic phases.

RESUMO O tecido adiposo é uma fonte apropriada de células-tronco mesenquimais (MSCs), as quais demonstram ampla plasticidade com capacidade de transdiferenciar em diversas linhagens. No presente estudo, as células-tronco mesenquimais derivadas do tecido adiposo (AT-MSC) foram isoladas de tecido adiposo localizado nas regiões próximas ao omento e testículos de camundongos. Primeiramente, as AT-MSCs foram comparadas com base na expressão de marcadores antigênicos de superfície e no potencial de diferenciação nas três linhagens mesodérmicas. Além disso, AT-MSC, de ambas as fontes, foram cultivadas com meio de diferenciação contendo ácido retinóico (RA) e / ou meio condicionado testicular (TCC). As AT-MSCs expressaram marcadores de superfície mesenquimais e diferenciaram nas linhagens adipogênica, condrogênica e osteogênica. Após o tratamento com RA, somente as AT-MSCs isoladas do tecido adiposo depositado na região do omento expressaram um único importante marcador relacionado às células da linhagem germinativa masculina. Estes resultados reafirmam a importância do tecido adiposo como fonte de células-tronco estromais-multipotentes, bem como, uma fonte de MSCs para estudos de diferenciação.

ABSTRACT The adipose tissue is a reliable source of Mesenchymal stem cells (MSCs) showing a higher plasticity and transdifferentiation potential into multilineage cells. In the present study, adipose tissue-derived mesenchymal stem cells (AT-MSCs) were isolated from mice omentum and epididymis fat depots. The AT-MSCs were initially compared based on stem cell surface markers and on the mesodermal trilineage differentiation potential. Additionally, AT-MSCs, from both sources, were cultured with differentiation media containing retinoic acid (RA) and/or testicular cell-conditioned medium (TCC). The AT-MSCs expressed mesenchymal surface markers and differentiated into adipogenic, chondrogenic and osteogenic lineages. Only omentum-derived AT-MSCs expressed one important gene marker related to male germ cell lineages, after the differentiation treatment with RA. These findings reaffirm the importance of adipose tissue as a source of multipotent stromal-stem cells, as well as, MSCs source regarding differentiation purpose.

Este estudo descreve o efeito da esfingosina 1-fosfato (S1P) no desenvolvimento de folículos pré-antrais, portanto da ativação e viabilidade de folículos caprinos cultivados in vitro. Fragmentos de ovários foram cultivados por um ou sete dias em meio essencial mínimo com diferentes concentrações de S1P (0, 1, 10, 50, 100 ou 200ng/mL). Os fragmentos de ovário foram processados para análise histológica em microscopia óptica, microscopia eletrônica e microscopia de fluorescência. O tratamento usando 1ng/mL de S1P foi capaz de manter a porcentagem de folículos normais durante o período de cultivo de sete dias. Ao final do período de cultivo, houve uma redução significativa (p<0,05) na porcentagem de folículos primordiais em todos os grupos tratados com S1P, comparados com os grupos controle (FC e CC), seguida por um aumento do número de folículos ativados (intermediários, primários e secundários). Adicionalmente, na cultura por sete dias com meio suplementado com S1P (1ng/mL), houve preservação da ultraestrutura das organelas e manteve-se a viabilidade dos folículos pré-antrais avaliados por microscopia de fluorescência. Em conclusão, após sete dias de cultura, o meio suplementado com 1ng/mL de S1P ativa o desenvolvimento de folículos pré-antrais de caprino, cultivados in situ e mantém as viabilidades oocitária e folicular.

This study describes the effect of sphingosine 1-phosphate (S1P) for development of preantral follicle, therefore the activation and follicular viability of caprine follicles cultured in vitro. Ovarian fragments were cultured for 1 or 7 days in Minimum Essential Medium with different S1P concentrations (0, 1, 10, 50, 100 or 200ng/mL). All ovarian fragments were processed for histological analysis in optical microscopy, transmission electron microscopy and fluorescence analysis. The treatment using 1ng/mL of S1P was able to maintain the percentage of normal follicles with the progression of the culture from day 1 to 7. At end of the 7-day culture period there was a significant reduction (P<0.05) in the percentage of primordial follicles in all groups treated with S1P, compared with fresh control (FC) and Control Culture (CC), which was followed by an increase of activated follicles (intermediary, primary and secondary). In addition, the culture for 7 days with media supplemented with S1P with 1ng/mL preserved the ultrastructure of organelles and kept the preantral follicular viability when evaluated by fluorescence microscopy. In conclusion, after 7 days of culture, the 1ng/mL of S1P activates the development of preantral caprine follicles, cultured in situ and maintains the oocitary and follicular viability.

Foram estudadas a presença de anexina II (Ann-II) durante a fase inicial do desenvolvimento embrionário bovino e sua regulação pelo retinol e pelo fator de crescimento semelhante à insulina (IGF-I). Embriões bovinos em diferentes estádios de desenvolvimento foram produzidos in vitro em fluido sintético de oviduto (SOF) sem suplementação (grupo-controle) ou suplementado com retinol (grupo retinol; 0,1ng/ml medium) ou IGF-I (grupo IGF-I; 10 ng/ml de meio). Os embriões foram processados para extração de mRNA, produção de cDNA e posterior análise por reação em cadeia da polimerase (PCR) com oligonucleotídeos específicos para Ann-II. Em todos os estádios de desenvolvimento embrionário, Ann-II foi detectada, exceto no estádio de 16 células. Os índices de blastocisto foram significativamente maiores (P<0,05) no grupo suplementado com retinol (37,8%, 45/119) durante o cultivo in vitro de embriões (PIV) que aqueles obtidos no grupo controle (20,5%, 24/117) ou no IGF-I (25,8%, 24/93). Análise semiquantitativa da expressão de Ann-II em embriões produzidos em meio suplementado com IGF-I ou retinol revelou uma menor expressão desse gene quando comparado com embriões cultivados somente em SOF (P<0,05). A expressão de Ann-II não foi diferente em embriões cultivados na presença de retinol e IGF-I. A presença de retinol aumentou a produção de embriões in vitro, e diminuiu a expressão de Ann-II em estádios iniciais do desenvolvimento embrionário bovino.

The presence of annexin II (Ann-II) during the initial stages of bovine embryo development and the regulation of Ann-II expression by retinol and insulin-like growth factor I (IGF-I) were studied. Bovine embryos at different stages of development were produced in vitro on Synthetic Oviductal Fluid (SOF) medium (control group), SOF supplemented with retinol (retinol group; 0.1ng/ml), or IGF-I (IGF-I group; 10ng/ml). The embryos were processed for mRNA extraction, cDNA production and polymerase chain reaction (PCR) using Ann-II-specific oligonucleotides. Ann-II was detected in all stages of early embryo development, except for the 16-cell stage. The blastocyst rates were significantly higher (P<0.05) in the group supplemented with retinol (37.8%, 45/119) during in vitro embryo culture (IVC) than in those cultured in SOF (20.5%, 24/117) or SOF with IGF-I (25.8%, 24/93). Semiquantitative analysis of Ann-II expression in embryos produced in medium supplemented with IGF-I or retinol revealed a lower expression of this gene when compared with embryos cultured in SOF (P<0.05). The Ann-II expression was not different in embryos cultured in the presence of retinol and IGF-I. The presence of retinol increased the production of embryos in vitro by decreasing the expression of Ann-II in early-stage of bovine embryo.

Estudou-se a associação entre polimorfismos de conformação de fita simples (SSCP) no gene do receptor do fator-I de crescimento semelhante à insulina (IGF-IR) e idade ao primeiro parto (IPP), intervalo entre partos (IEP), duração da lactação (DL) e produção de leite (PL), em 106 fêmeas puras por cruza da raça Holandesa. A reação em cadeia da polimerase (PCR) com oligonucleotídeos iniciadores específicos gerou um fragmento de 335pb. A freqüência genotípica da população para o polimorfismo foi 82,1% de indivíduos homozigotos para o alelo A e 17,9% de heterozigotos (AB). A freqüência do alelo A foi 0,91 e a do alelo B, 0,09. Não foi encontrada associação entre o polimorfismo estudado e as características IPP, IEP e PL. A característica DL foi positivamente associada (P<0,05) à ausência do alelo B. A lactação dos animais portadores do genótipo AA foi mais longa.

The association between single-strand conformation polymorphism (SSCP) in the gene of insulin-like growth factor-I receptor (IGF-IR) and age at first calving (AFC), calving interval (CI), lactation length (LL), and milk yield (MY) was studied using 106 graded Holstein females. The polimerase chain reaction (PCR) with specific initiating oligonucleotides, resulted an amplified fragment of 335pb. The population genotypes frequencies were 82.1% and 17.9%, for AA and AB genotypes, respectively. The frequency of A allele was 0.91 and 0.09 of B allele. No association between the identified polymorphism and AFC, CI, and MY was observed. The LL was positively associated (P<0.05) with the absence of B allele. Animals carrying the AA genotype presented a longer lactation period.

Verificou-se a influência da proteína quinase C (PK-C) no reinício e na progressão da meiose em oócitos bovinos, determinando se as células do cumulus são mediadoras da PK-C na regulação da maturação dos oócitos. Complexos cumulus-oócitos (CCO) e oócitos desnudos (OD), distribuídos aleatoriamente em seis tratamentos (T) com base na presença de um ativador da PK-C (PMA) (T1 e T2), de um forbol éster incapaz de ativar a PK-C (4alfa-PDD-controle) (T3 e T4) ou de apenas o meio básico (TCM-199-controle) (T5 e T6), foram cultivados por 7, 9, 12, 18 e 22 horas. A percentagem de rompimento da vesícula germinativa no grupo cultivado com PMA foi maior do que nos dois grupos controle, com e sem células do cumulus. O cultivo de CCO e OD por 12 e 18 horas demonstrou que a PK-C influencia a progressão para os estádios de metáfase I (MI) e metáfase II (MII) de maneira dependente das células do cumulus. Nos períodos de 9 e 22 horas, não foi possível observar diferença entre os grupos quanto aos diferentes estádios de maturação. A ativação da PK-C acelera o reinício da meiose independentemente das células somáticas e acelera a progressão até os estádios de MI e MII na dependência das células do cumulus.

The aim of this study was to evaluate the effect of protein kinase C (PK-C) on the meiotic resumption and progression in bovine oocyte, and to determine if the cumulus cells mediate the PK-C action in the regulation of bovine oocyte nuclear maturation. Cumulus-oocyte complexes (COC) and denuded oocytes (DO), randomly allotted to 6 treatments (T) based on the presence of an activator of PK-C (PMA) (T1 and T2), or a phorbol ester unable to activate PK-C (4alphaPDD-control) (T3 and T4) or a basic culture medium (T5 and T6), were cultivated for 7, 9, 12, 18 and 22 hours. The percentage of germinal vesicle breakdown (GVBD) was higher when the oocytes were cultured with PMA than in the control groups with and without cumulus cells. However, PK-C was dependent of cumulus cells to affect the progression to the stages of metaphase I (MI) and metaphase II (MII) at 12 and 18 hours of culture. At 9 and 22 hours, no difference among groups was detected. PK-C accelerates the meiotic resumption independently of the somatic cells but depends on cumulus cells for the progression to the stages of MI and MII.

Este trabalho teve por objetivo avaliar a eficiência de tratamentos hormonais sobre a fertilidade de vacas de corte no pós-parto com diferentes condições corporais, durante a estação de monta de outono. Setenta e três vacas pluríparas cruzadas (Hereford x Nelore) criadas extensivamente, com condição corporal entre 2 e 4, foram pesadas e distribuídas em três grupos experimentais. O grupo GSED, constituído por 25 vacas, recebeu pessário vaginal (dia 0) contendo 250mg de acetato de medroxiprogesterona e 500mg de somatotropina bovina recombinante (bST-r). Na retirada dos pessários (dia 7), as vacas receberam 0,5mg de cipionato de estradiol e procedeu-se o desmame temporário dos bezerros por 72 horas. No grupo SED, 25 vacas receberam tratamento semelhante ao grupo GSED, porém não receberam bST-r. No grupo-controle, as 23 vacas somente foram separadas dos seus bezerros por 72h. Quando da retirada dos pessários as vacas foram colocadas com touros por 30 dias. Os animais foram pesados e avaliados quanto à condição corporal no início do experimento e na retirada dos touros (dia 37). Foi constatada perda média de peso de 0,648 kg/dia e os percentuais de estro foram de 26,1%, 33,3% e 56,5%, respectivamente, para os grupos controle, SED e GSED. O diagnóstico de gestação, realizado pela palpação retal 60 dias após a retirada dos touros, indicou percentuais de prenhez de 13,0%, 8,3% e 21,7%, respectivamente, para os grupos controle, SED e GSED (P=0,16), demonstrando que os programas hormonais adotados não foram eficientes no incremento das taxas de prenhez de vacas que perdiam peso entre 50 e 70 dias após o parto.

This study aimed to assess the efficiency of hormonal treatment in the postpartum fertility of nursing beef cows. Seventy-three cows (Hereford x Nellore) raised extensively, with body condition ranging from 2 to 4 were randomly allotted in three groups. The GSED group, with 25 cows, received an intravaginal device (ID) of 250mg of medroxiprogesteron acetate and 500mg of recombinant bovine somatotropin (bST-r; day 0). After the ID withdrawal (day 7), the cows received 0.5mg of estradiol cipionate; their calves were temporarily weaned for 72 hours. In the SED group, 25 cows received a similar treatment, however, somatotropin was not used. In the control group, 23 cows were temporarily separated from their calves for 72 hours and did not receive any hormonal treatment. The cows were put together with the bulls for 30 days just after ID withdrawal. The cows were weighted and assessed for body condition at day 0 and just after bulls withdrawal. The cows lost weight in an average of 0.648 kg/day, and 56.5%, 33.3%, and 26.1% of estrous rates were observed, respectively for the GSED, SED and control groups (GSED vs. SED, P=0.0001; GSED vs. control, P=0.0007; SED vs. control, P=0.53). The pregnancy rates were 21.7%, 8.3%, and 13.0%, respectively for the GSED, SED and control groups (P=0.16). The results showed that the hormonal program associated with temporary 72-hour calf removal did not increase conception rate of cows that loosed weight from 50 to 70 days postpartum.

O objetivo deste trabalho foi verificar as ações do fator de crescimento derivado das plaquetas (PDGF; P), da insulina (I), do retinol (R) e de suas associações (PI, PIR, IR e PR) na maturação nuclear (MN) de oócitos bovinos e suas conseqüências no desenvolvimento embrionário (DE). O meio básico para maturação dos oócitos nos diferentes tratamentos foi o TCM-199 modificado acrescido de PVA (controle). No DE, foram utilizados os grupos R, PIR, IR, um controle negativo (PVA) e um controle positivo, contendo soro fetal bovino e gonadotrofinas (SFBHOR). Os fatores P, I, R e suas associações não aceleraram a MN em 7h mas sim após 18h (P<0,001), com exceção dos tratamentos R e PR, nos quais as percentagens de metáfase II foram, respectivamente, de 4,7% e 8,3%, similares à obtida no grupo-controle (0,0%). Considerando um nível de significância de P<0,0001 em comparação ao grupo-controle, os maiores índices de metáfase II foram obtidos na presença das associações IR (19,0%) e PIR (21,3%). No DE, R (18,3%), PIR (13,9%) e IR (10,6%) incrementaram os índices de clivagem, comparados ao PVA (0,0%; P<0,001), porém não atingiram os índices do grupo SFBHOR (53,8%; P<0,001). Conclui-se que insulina e PDGF aceleram a MN e suas ações são potencializadas pelo retinol. Os índices de clivagem de oócitos maturados na presença de R, IR e PIR são superiores aos do PVA, mas significativamente inferiores aos maturados em SFBHOR.

The aim of the present study was to determine the effect of platelet-derived growth factor (PDGF; P), insulin (I) retinol, (R) and their interactions (PI, PIR, IR and PR) on oocyte nuclear maturation (NM) and, consequent, embryonic development (ED). The basic medium for oocyte maturation in the treatments was the modified TCM-199, supplemented with PVA (control). To study the embryonic development, the oocytes were divided in three treatments, R, PIR e IR, a negative (PVA) and a positive control group (containing calf fetal serum and gonadotrophic hormones; FCSHOR). The PDGF, insulin, retinol and their interactions did not change the kinetic of the NM, in seven hours of culture (P=0.4492) but it changed after 18 hours of maturation (P<0.001) except in the treatments R and PR (P<0.001), in which the percentages of metaphase II were, respectively, 4.7% and 8.3%. These results were similar to the control group (0.0%). Considering a significant level of P<0.0001 in comparison to the control group, the higher rates of metaphase II were obtained in the presence of IR (19.0%) and PIR (21.3%). The higher rates of MII were observed when the oocytes were matured in the presence of insulin and retinol. In the embryonic development, R (18.3%), PIR (13.9%) and IR (10.6%) increased the rate of cleavage when compared to PVA group (0.0%; P<0.001). However, the oocytes were not competent enough to reach the rate obtained in the FCSHOR group (53.8%; P<0.001). In conclusion, insulin and PDGF accelerate NM and their effects are enhanced by retinol. In the embryonic development, oocytes matured in the presence of either R, IR or PIR have higher cleavage rate than PVA group but lower than those matured in the FCSHOR group.