O Mycoplasma é considerado cosmopolita, podendo ser disseminado através do comércio internacional de animais, sêmen industrializado e de produtos de transferência de embriões. A expansão de células do cumulus é utilizada como parâmetro de avaliação de oócitos bovinos cultivados in vitro e suas alterações morfológicas são representativas. O objetivo deste trabalho foi avaliar a interação do Mycoplasma bovigenitalium, exposto experimentalmente à cultura primária de célula do cumulus, após o período de maturação. Complexos oócitos cumulus (COCs) obtidos através de punção folicular de ovários bovinos, provenientes de abatedouro, foram divididos em dois grupos para serem maturados durante 24h em meio de maturação (TCM199 + hormônios) em estufa a 38º C, 5% de CO2, 95% de umidade. Posteriormente, os oócitos foram retirados das placas, permanecendo somente com as células do cumulus aderidas. Com o monoestrato celular formado, um grupo foi infectado com 30 mL de M. bovigenitalium, replicado em meio Hayflick modificado a 37º C em estufa de microaerofilia, enquanto o outro foi mantido como controle. Os resultados mostraram que, com 24h de exposição ao patógeno, as culturas apresentaram um pequeno número de células arredondadas e granulosas, quando comparadas as dos controles. Esse efeito persistiu até o sétimo dia, onde se iniciou um processo de descolamento das células. Pode-se concluir que uma contaminação por micoplasma pode ser imperceptível às manipulações da FIV, pois células infectadas por esse grupo de bactérias não apresentam turvações no meio de cultura e, quando não lisam a célula hospedeira, tornam mais suscetível ao ambiente e outros agentes infecciosos.

The Mycoplasma is considered cosmopolitan and can be disseminated through international trade of animals, industrialized semen and embryo transfer products. The expansion of cumulus cells is used as a parameter for evaluating cattle oocytes cultivated in vitro, and their morphological changes are representative. The aim of the present study was to evaluate the interaction of Mycoplasma bovigenitalium with primary-culture cumulus cells, after the in vitro maturation period. Cumulus complex oocytes (COCs) obtained through follicular puncture of ovaries from a cattle slaughterhouse were divided into two groups to be matured for 24 hours in the maturation medium (TCM 199 + hormones) in a climate controlled chamber at 38º C, 5% CO2, and 95% humidity. Subsequently, the oocytes were removed from the plates, which remained with only the cumulus cells attached. With the monostratum cell formed, one group was infected with 30 ºL (5 x 10(6) cells/mL) M. bovigenitalium, replicated in modified Hayflick medium at 37º C in a mycroaerofilic chamber, while the other was kept as a control. The results showed that with 24 hours of exposure to the pathogen, the cultures showed a small number of rounded and grainy cells, when compared to the controls. This effect persisted until the 7th day, when a process of cell detachment began. It can be concluded that a mycoplasma contamination may be imperceptible to the manipulations of FIV, because cells infected by this group of bacteria present no cloudiness in the culture field, and when they do not lyse the host cell, they make it more susceptible to environment and other infectious agents.

Avaliou-se a eficácia dos tratamentos, definidos pela International Embryo Transfer Society (IETS), de oócitos bovinos, maturados in vitro e expostos experimentalmente à Leptospira interrogans sorovar Grippotyphosa. Os oócitos foram obtidos por meio de punção folicular, selecionados e distribuídos em quatro grupos, expostos ao patógeno e submetidos aos diferentes tipos de tratamentos. Foram expostos à cepa na concentração de 4,7.10(5)/µL, virulenta e não adaptada ao meio de manutenção EMJH, e, de 6,3.10(5)/µL, avirulenta e adaptada ao meio, por 24 horas. Os grupos tratados com tripsina ou antibióticos apresentaram eficácia de 21,7%, e o grupo lavado sequencialmente 33,4%. Os tratamentos não foram eficazes para os contaminados com a cepa avirulenta. Concluiu-se que as normas de controle de qualidade estabelecidas pela IETS poderiam ser revisadas e, possivelmente, redefinidas, uma vez que a eficácia dos tratamentos, provavelmente, não depende somente da espécie do patógeno, pois há interferência da virulência e de ação dos tratamentos sobre o tipo de patógeno.

The research purpose was to evaluate the effectiveness of treatments established by the IETS, in bovine oocytes maturated in vitro, exposed experimentally to Leptospira interrogans serovar Grippotyphosa. The oocytes were obtained through follicular puncture, selected and randomly allotted in four groups, exposed to the pathogen and subjected to different types of treatments. They were exposed to the strain in the concentration of 4.7x10(5)/µL virulent and not adapted to the EMJH, and to 6,3x10(5)/µL, virulent and adapted to the medium, for 24 hours. The treatments presented for the groups with trypsin or antibiotics, 21.7% efficiency, and the group washed sequentially presented 33.4% efficiency. The treatments were not effective for those infected with avirulent strain. In the statistical analysis, by χ², was found significance in the results obtained. The standards of quality control established by IETS could be reviewed and possibly redefined, since the effectiveness of treatment probably depends not only on the species of the pathogen, but is also affected by its virulence and treatment effectiveness.

RESUMO A pleuropneumonia suína, causada pelo Actinobacillus pleuropneumoniae, é uma importante doença respiratória, responsável por prejuízos e queda de produtividade nas criações. Este trabalho teve como objetivo determinar a ocorrência de A. pleuropneumoniae em amostras de campo, mediante a adaptação e emprego de uma técnica de nested-PCR dirigida ao gene Apx IV. Definiu-se a sensibilidade analítica das técnicas de PCR e nested-PCR utilizando a amostra padrão A. pleuropneumoniae sorotipo III, em concentrações de DNA variando entre 30 µg/mL a 0,01 ng/ mL. Um total de trinta e sete amostras de campo encaminhadas ao Instituto Biológico entre 1995 a 2007 foram analisadas pelas técnicas de PCR e nested-PCR. A avaliação da sensibilidade analítica revelou que a PCR possui capacidade de gerar sinal a partir de 2 ng/mL de DNA extraído e a nested-PCR a partir de 0,4 ng/mL. Uma vez que a nested-PCR apresentou sensibilidade analítica cinco vezes maior se comparada à PCR para detecção de A. pleuropneumoniae em amostra padrão, o seu emprego pode minimizar a ocorrência de resultados tipo “falso-negativo”. Dentre as amostras testadas, dez foram positivas à nested-PCR, sendo observada a ocorrência de A. pleuropneumoniae em nove diferentes animais, um deles javali. A presente técnica de nested-PCR pode ser utilizada para detecção direta de A. pleuropneumoniae em amostras de campo, mesmo após congelamento da amostra por longos períodos e sem necessidade de isolamento bacteriano prévio.

ABSTRACT Porcine pleuropneumonia, caused by Actinobacillus pleuropneumoniae, is an important respiratory disease, responsible for economic losses and reduced productivity. The aim of this study was to determine occurrence of A. pleuropneumoniae in field samples, using an adapted nested-PCR reaction targeting the Apx IV gene. Different DNA concentrations (from 30 µg/mL to 0.01 ng/mL) of A. pleuropneumoniae serotype III reference strain were used to determine the level of sensitivity of first generation and nested-PCR reactions. Thirty-seven field samples sent to Instituto Biológico from 1995 to 2007 were tested by PCR and nested-PCR. Determination of the level of sensitivity showed that PCR could amplify to 2 ng/mL of extracted DNA and nested-PCR to 0.4 ng/mL. Since the nested reaction exhibited a level of sensitivity 5 times greater than the PCR reaction to detect a reference strain, using nested-PCR could minimize the occurrence of false-negative results. Among tested samples, 10 of them were nested-PCR positive, showing occurrence of A. pleuropneumoniae in 9 different animals (including one wild boar). This nested-PCR reaction can be used for direct detection of A. pleuropneumoniae in field samples, even after frozen storage for long periods, without the need for previous bacterial isolation.