RESUMO: A Transferência Nuclear de Células Somáticas (TNCS-Clonagem) é uma técnica promissora em várias áreas, e se baseia na produção de indivíduos geneticamente idênticos. No entanto, sua eficiência é baixa. Estudos sugerem que a principal causa seja uma reprogramação epigenética inadequada. O objetivo desse trabalho é caracterizar o padrão de metilação da região éxon 10 do gene IGF2 e da Região Controladora de Imprinting (ICR) do gene H19 na placenta de bezerros clonados. Para a execução do trabalho foram selecionados clones bovinos fêmeas e machos, apresentando diferentes fenótipos. O DNA da placenta desses animais foi extraído, e em seguida foi tratado com bissulfito de sódio e amplificado para os loci ICR/H19 e IGF2. Os produtos da PCR foram clonados em bactérias competentes e, por fim, sequenciados. Foi encontrada uma diferença significativa entre os controles e os clones com fenótipos saudáveis para a região da ICR/H19. Nesta região, os controles tiveram um padrão hemimetilado, como previsto pela literatura, devido essa região ser imprinted. Enquanto os clones encontravam-se menos metilados. Para a região do éxon 10 do IGF2, não foi encontrada diferença significativa entre controles e clones. Estes resultados sugerem que as diferentes regiões do genoma podem se reprogramar independente umas das outras e que falhas na reprogramação do padrão de metilação do DNA de genes imprinted podem ser uma das causas da baixa eficiência da TNCS.

ABSTRACT: Somatic Cell Nuclear Transfer (SCNT-Cloning) is a promising technique in many areas and is based on genetically identical individuals. However, its efficiency is low. Studies suggest that the leading cause is inadequate epigenetic reprogramming. This study aimed to characterize the methylation pattern of the exon 10 regions of the IGF2 gene and the Imprinting Control Region (ICR) of the H19 gene in the placenta of cloned calves. For this study, female and male cloned calves presenting different phenotypes were used. Genomic DNA from these animals’ placenta was isolated, then treated with sodium bisulfite and amplified to the ICR/H19 and IGF2 loci. PCR products were cloned into competent bacteria and finally sequenced. A significant difference was found between controls and clones with healthy phenotypes for the ICR/H19 region. In this region, controls showed a hemimethylated pattern, as predicted in the literature due to this region has an imprinted control, while clones were showed less methylated. For the IGF2, no significant differences were found between controls and clones. These results suggest that different genomic regions in the genome may be independently reprogrammed and that failures in reprogramming the DNA methylation patterns of imprinted genes may be one of the causes of the low efficiency of SCNT.

RESUMO: 5-metilcitosina (5-mC) e 5-hidroximetilcitosina (5-hmC) são citosinas modificadas encontradas nos mamíferos que estão envolvidas com a regulação da expressão gênica. O objetivo do presente estudo foi caracterizar os padrões globais de 5-mC e 5-hmC em placenta fetal de animais da raça Nelore, assim como em sangue e espermatozoides, usados como controles. Os níveis de 5-mC e 5-hmC foram determinados usando os kits MethylFlash Methylated/Hydroxymethylated DNA Quantification, respectivamente. Tecidos placentários apresentaram menores níveis de 5-mC e 5-hmC quando comparados com espermatozoides. Cotilédones de machos apresentaram maiores níveis de 5-hmC do que os de fêmeas. Os níveis de 5-mC e 5-hmC em animais Bos taurus indicus foram caracterizados pela primeira vez, o que pode contribuir para o nosso conhecimento sobre a regulação dos mecanimos epigenéticos na placenta. A presença de 5-hmC em tecidos somáticos sugerem que essa base pode ter sua própria função biológica, sendo não somente um sub-produto da oxidação da 5-mC. Esses resultados podem ser de interesse nas Tecnologias de Reprodução Assistida, especialmente na clonagem, no diagnóstico/prognóstico de placentação aberrante e viabilidade da progênie.

ABSTRACT: 5-methylcytosine (5-mC) and 5-hydroxymethylcytosine (5-hmC) are modified cytosines found in mammals that are involved in the regulation of gene expression. The aim of this study was to characterize the global patterns of 5-mC and 5-hmC of the fetal placenta of Nellore cattle as well as blood and sperm as controls. 5-mC and 5-hmC levels were determined using MethylFlash Methylated/Hydroxymethylated DNA Quantification Kit, respectively. Placenta tissues showed lower levels of 5-mC and 5-hmC compared to sperm. The male cotyledon showed higher levels of 5-hmC than the female. For the first time, the levels of 5-mC and 5-hmC in Bos taurus indicus were characterized, which may contribute to our understanding of the mechanisms of epigenetic regulation in the placenta. The presence of 5-hmC in somatic tissues suggest that 5-hmC has its own biological function and it is not only a byproduct from the oxidation of 5-mC. These results may be of interest in ARTs, especially in cloning in the diagnosis/prognosis of aberrant placentation and the viability of pregnancies.

RESUMO: Para a avaliação dos parâmetros bioquímicos séricos de jumentos (Equus asinus) da raça Pêga, quanto às diferentes faixas etárias e sexo, foram analisadas amostras sanguíneas de 123 animais, sendo 29 machos com idades de 8 dias a 10 anos e 94 fêmeas (15 lactantes) de 2 dias a 12 anos, de dois criatórios na região centro-sul do estado de Minas Gerais. Os animais foram divididos em 5 grupos de acordo com as idades: Grupo 1 (≤6 meses); Grupo 2 (7-12 meses); Grupo 3 (13-48 meses); Grupo 4 (49-72 meses) e Grupo 5 (≥73 meses). De acordo com o sexo, foram divididos em dois grupos, machos e fêmeas. Para todos os animais foram realizadas as análises de proteínas totais, albumina, globulinas, relação A:G, colesterol, triglicérides, ácido úrico, creatinina, ureia, fósforo, cálcio, relação Ca:P, magnésio, alanina aminotransferase (ALT), aspartato aminotransferase (AST), fosfatase alcalina (FAL), gama glutamiltransferase (GGT) e creatina quinase (CK). Não foram encontradas diferenças significativas para os elementos globulinas, ácido úrico, ureia e relação A:G entre as faixas etárias. O Grupo 4 apresentou os maiores valores para proteínas totais quando comparados aos animais dos grupos 1 e 2. Os animais do Grupo 2 mostraram valores de albumina inferiores aos Grupos 3 e 4. Os animais do Grupo 1 apresentaram valores de colesterol superiores aos do Grupo 2 e 4, e semelhante aos demais grupos. Maior concentração sérica de fósforo foi observada nos animais do grupo 1. O cálcio apresentou valor significativamente menor no Grupo 2. A relação Ca:P foi maior para o grupo 5. Os valores do magnésio foram estatisticamente superiores nos animais com idade superior a 49 meses (Grupos 4 e 5). O valor da AST foi menor para o Grupo 1.As enzimas FAL apresentaram valor significativamente maior nos animais mais jovens até 12 meses, seguida de redução gradual com o avançar da idade. Os valores da GGT foi maior nos jumentos com até seis meses de idade, seguido de valores decrescentes para os grupos subsequentes. Não foram encontradas diferenças entre os sexos para albumina, colesterol, creatinina, ureia, ácido úrico, relação Ca:P, magnésio, ALT, AST e fosfatase alcalina. As fêmeas tiveram valores maiores para proteínas totais, globulinas e triglicérides. Os machos mostraram maiores valores para relação A:G, fósforo, cálcio e CK. Pelos resultados nota-se que a idade e o sexo podem influenciar nos valores bioquímicos séricos dos jumentos da raça Pêga.

ABSTRACT: For the evaluation of serum biochemical parameters of Pêga breed donkeys (Equus asinus), for the different age groups and sex, blood samples of 123 animals were analyzed, of 29 males aged from 8 days to 10 years and of 94 females (15 lactating) aged from 2 days to 12 years, from two farms in the central-southern Minas Gerais, Brazil. The donkeys were divided by age into 5 groups: Group 1 (≤6 months), Group 2 (7-12 months), Group 3 (13-48 months), Group 4 (49-72 months), and Group 5 (≥73 months). According to the sex, they were divided into two groups, males and females. Serum biochemical elements: total protein, albumin, globulin, the A:G ratio, cholesterol, triglycerides, uric acid, creatinine, urea, phosphorus, calcium, Ca:P ratio, magnesium, alanine aminotransferase (ALT), aspartate aminotransferase (AST), alkaline phosphatase (ALP), gamma glutamyl transferase (GGT) and creatine kinase (CK), were evaluated in all animals. No significant differences were found for globulins, uric acid, urea and A:G ratio between age groups. Group 4 showed the highest values for total protein when compared with animals in Group 1 and 2. In Goup 2, the donkeys showed albumin levels lower than Group 3 and 4. Group 1 they had cholesterol levels higher than those in Group 2 and 4, and similar of the other groups. Higher phosphorus serum concentration was observed in Group 1. Calcium was significantly lower in Group 2. The Ca:P ratio was higher for Group 5. The magnesium values were significantly higher in donkeys older than 49 months (Group 4 and 5). The value of AST was lower for group 1. The ALP enzyme was significantly higher in younger animals up to 12 months, followed by gradual decrease with advancing age. The values of GGT were higher in donkeys up to 6 months, followed by decreasing values for subsequent groups. No differences were found between genders for albumin, cholesterol, creatinine, urea, uric acid, Ca:P ratio, magnesium, ALT, AST, and alkaline phosphatase. Females had higher values for total protein, globulin and triglycerides. Males showed higher values for A:G ratio, phosphorus, calcium and CK. The results showed that age and sex can influence serum biochemical values of Pêga breed donkeys.