Resumo Têm sido estudados os efeitos de pH e fosfatos orgânicos no equilíbrio e propriedades cinéticas na união de ligantes das hemoglobinas de dois peixes relacionados à Amazônia, Osteoglossum bicirrhosum de respiração branquial obrigatória e Arapaima gigas, de respiração aérea obrigatória. As hemoglobinas de ambos os peixes exibem, um efeito Root, a mínima afinidade pelo oxigênio esta associada com a completa perda da cooper atividade na união do ligante. Nesta baixa afinidade, estado T, há uma grande heterogeneidade das unidades de ambas as hemoglobinas como é evidenciado pelo coeficiente de Hill menor a, unidade e a cinética bifásica na combinação de monóxido de carbono. A maior diferença nas propriedades das hemoglobinas destes dois peixes é encontrada a pH altos (acima de pH 8) onde ambas as hemoglobinas exibem sua mais alta afinidade pelo ligante. Aqui ambas as hemoglobinas diferem em sua afinidade e cooperatividade com a qual elas se unem a seus ligantes, tendo a hemoglobina de Arapaima a menor afinidade porém a mais alta cooperatividade.

Summary The effects of pH and organic phosphate on the equilibrium and kinetic properties of the binding of ligands to the hemoglobins of two related Amazonian fish, Osteoglossum bicirrhosum, an obligate water breather, and Arapaima gigas, an obligate air breather, have been studied. The hemoglobins of both fish exhibit a Root effect, and the minimum oxygen affinity is associated with the complete loss of cooperative ligand binding. In this low affinity, T state, there is great subunit heterogeneity in both hemoglobins as evidenced by Hill coefficients well below unity and biphasic carbon monoxide combination kinetics. The greatest difference in the properties of the hemoglobins of these two fish is found at high pH (above pH 8) where both hemoglobins exhibit their highest ligand affinities. Here the hemoglobins differ both in the affinity and cooperativity with which they bind ligands, Arapaima hemoglobin having the lowest affinity but the highest cooperatively.

Resumo O componente único da hemoglobina de Brachyplatysoma sp, tem um peso molecular aparente de 69000 determinado por filtração de gel. A hemoglobina apresenta efeito Bohr tanto ácido quanto básico, efeito de fosfato orgânico e não apresenta efeito Root. O P1/2, de oxigênio do sangue completo varia de 10.7 mm Hg em soluções equilibradas no ar até 25,1 mm Hg após a adição de 5,6% CO2 ao gás equilibrado. O efeito Bohr medido para hemoglobina "stripped" entre pH 7,0 e 8,0 é Δ log P1/2/Δp = H —0,23. Adições de 1mM ATP induzem mudança no efeito Bohr a Δ log P1/2/Δ pH = —0,58 na mesma faixa de pH. O valor n das soluções de hemoglobina "stripped" varia de 1 a pH 7,0. Adições de 1mM ATP mudam a variação de n a valores de pH mais altos causando um aumento no valor de n, n=2 a pH 7,4. As cinéticas da ligação de monóxido de carbono e dissociação de oxigênio são dependentes do pH. A taxa CO "on" vira autocatalítica à medida que o pH diminui, indicando interações positivas das subunidades. A taxa O2 "off" foi homogênea a todos os valores do pH. Os efeitos Bohr da hemoglobina de Brachyplatystoma e outras hemoglobinas de pimeloidídeos são maiores que as determinadas para as hemoglobinas não fraccionadas de espécies mais sedentárias de outras famílias de bagres, tais como Loricariidae e Callichthyidae.

Summary The single hemoglobin component of Brachyplatystoma sp. has been isolated. The CO-hemoglobin has an apparent molecular weight of 69,000 as determined by gel filtration. The hemoglobin displays both acid and alkaline Bohr effects, an organic phosphate effect and no Boot effect. The whole blood p1/2 for oxygen shifts from 10.7 mm Hg in air equilibrated solutions to 25.1 mm Hg after the addition of 5.6% CO2to the equilibration gas. The p1/2 of purified hemoglobin varies from 0.3 mm Hg at pH 8.4 to 4.5 mm Hg at pH 5.9. The Bohr effect measured for stripped hemoglobin between pH 8.0 and 7.0 is Δ log p1/2/ΔpH = -0.23. Additions of 1 mM ATP induce a shift in the Bohr effect to Δ log p 1/2/ΔpH = -0,58 over the same pH range. The n value of stripped hemoglobin solutions varies from l at pH 5.9 to 1.7 at pH 7 0. Additions of 1 mM ATP shift the variation in n to higher pH values, and causes an increase in the n value, n = 2 at pH 7.4. The kinetics of carbon monoxide binding and oxygen dissociation are pH dependent. The COon rate becomes autocatylytic as the pH is lowered, indicating positive subunit interactions. The O2off rate was homogeneous at all pH values. The Bohr effects of Brachyplatystoma hemoglobin and other pimelodid hemoglobins are greater than those determined for the unfractionated hemoglobins of more sedentary species from other catfish families such as the Loricariidae and Callichthyldae.

Resumo Heinocianinas de 4 organismos habitantes do rio Amazonas foram isoladas e parcialmente caracterizadas. Três espécies de artrópodos (Dilocarcinus pagei cristatus, Silviocarcinus pardalinus e Macrobrachium amazonicum) possuem hemocianinas cujas estruturas das subunidades são provavelmente simples. Eletroforese regular e eletroforese SDS em disco de poliacrilamida revelaram predominantemente bandas simples e nenhum polimorfismo. O experimento de ligação do oxigênio mostrou que as 3 hemocianinas dos artrópodos possuem um grande efeito Bohr e dependência do pH no grau de interações das subunidades. A hemocianina do molusco Pila sp, foi estudada e o tamanho de sua sub-unidade parece similar à das outras hemocianinas dos moluscos, i.e., polipeptídeo 400.000 dalton. Na de hemolinfa do molusco Pila, provavelmente existe uma mistura de agregados de 100S a 124S. As propriedades das ligações do oxigênio das grandes moléculas da hemocianina de Pila sp, são notáveis por sua baixa cooperatividade e perda da forte dependência do pH.

Summary Hemocyanins from four organisms inhabiting the Amazon River were isolated and partially characterized. Three arthropodan species (Dilocarcinus pagei cristatus, Silviocarcinus pardalinus and Macrobrachium amazonicum) posses hemocyanins whose subunit structure is remarkably simple. Regular and SDS polycrylamide disc electrophoresis revealed predominantly single bands and no polymorphisms. Oxygen-binding experiments showed that the three arthopodan hemocyanins possess large positive Bohr effects and pH dependence in the degree of subunit interaction. The hemocyanin of one mollusc, Pila sp., was studied and its subunit size appears to be similar to that of other molluscan hemocyanins, i.e., a 400,000 dalton polypeptide. In the hemolymph, Pila hemocyanin probably exists as a mixture of 100S and 124S aggregates. The oxygen binding properties of the large molecules of Pila hemocyanin are notable because of their low cooperativity and lack of a strong pH dependence.

Resumo Foram isoladas duas hemoglobinas de um peixe caracídeo, Mylossoma sp. O componente eletroforético de maior migração anódica constitui 89% do hemolisado total. As duas hemoglobinas nativas têm peso molecular aparente de 57.000 por cromatografia em gel. Os pesos moleculares aparentes das subunidades desnaturadas são 14.000 por eletroforese em gel de dodecil sulfato de sódio. Não ocorre polimerização depois da oxidação com ferrocianeto de potássio. O estudo da união de oxigênio indica que o componente mais "anódico" da hemoglobina possui um efeito Root. Em pH 5,9 na presença de 1 mM ATP a hemoglobina fica saturada apenas 45% quando equilibrada com ar a 1 atmosfera. O componente mais anódico possui um efeito Bohr normal que é aumentado em presença de 1 mM ATP. A cooperatividade, determinada por n na equação de Hill, varia com o pH. No pH 6,7 e abaixo deste na presença de 1 mM ATP, n < 1. A presença de 1 mM ATP causa uma redução em n em pH abaixo de 8,2. O comportamento menos anódico evidencia um comportamento muito diferente tendo um efeito Bohr reverso Δ log P1/2/Δ pH=0,14, entre pH 7,0 e 8,0 o qual muda para um efeito Bohr normal, Δ log P1/2/Δ pH= —0,13 com adição de 1 mM ATF. Esta hemoglobina mostra cooperatividade em todos os valores de pH estudados. Não mostra efeito Root. Estudos de cinética rápida da ligação CO e da dissociação do O2dos componentes isola dos da hemoglobina mostraram que ambos processos são dependentes do pH para cada componente. Estes resultados são consistentes com as análises dos dados de equilíbrio do oxigênio. As hemoglobinas de Mylossoma sp. se assemelham às de Hoplosternum, truta, salmão, remora e cadozete, no grau de sua diferenciação funcional e podem representar especializações evolutivas designadas para servir funções fisiológicas diversas.

Summary The two hemoglobins of a characid fish, Mylossoma sp. have been isolated. The more anodally migrating electrophoretic component constitutes 89% of the total hemolysate. The two native hemoglobins have apparent molecular weights of 57,000 by gel chromatography. The apparent molecular weights of the denatured subunits are 14,100 by sodium dodecyl sulfate gel electrophoresis. No polymerization occurs after oxidation with potassium ferricyanide. Oxygen binding studies indicate that the more anodal hemoglobin component possesses a Root effect. At pH 5.9 in the presence of 1 mM ATP the hemoglobin is only 45% saturated when equilibrated with air at one atmosphere. The more anodal component possesses a normal Bohr effect which is enhanced in the presence of 1 mM ATP. The cooperativity, as determined by n of the Hill equation varies with pH. At and below pH 6.7 in the presence of 1 mM ATP, n< 1. The presence of 1 mM ATP causes a reduction in n below pH 8.2. The less anodal component evinces very different behavior having a reverse Bohr effect a log p1/2Δ/ pH=0.14, between pH 7.0 and 8.0 which changes to a normal Bohr effect, Δ log p1/2/Δ pH = — 0.13 upon addition of 1 mM ATP. This hemoglobin shows cooperativity, at all pH values studied. It does not show a Boot effect. Rapid kinetic studies of CO binding and O2 dissociation of the isolated hemoglobin components show that both processes are pH dependent for each of the components. These results are consistent with the analysis of the oxygen equilibrium data. Mylossoma hemoglobins resemble those of Hoplosternum, trout, salmon, sucker and loach in the degree of their functional differentiation and may represent evolutionary specializations designed to serve diverse physiological functions.

Resumo O sistema de hemoglobina do jaraquí, Prochilodus sp. consiste em componentes múltiplos de hemoglobina. O derivado oxidado elui como uma espécie de único peso molecular em experimentos de filtração. O derivado carboxi tem um peso molecular aparente de 60.000 determinado por filtração de gel. Uma mudança de 44 vezes no p1/2 ocorre entre pH 6,4 e 8,6 na solução da hemoglobina. Esta mudança aumenta 388 vezes sob a mesma faixa de pH na presença de 1mM de ATP. A cooperatividade da união do oxigênio, medida por n na equação de Hill, é maior que um em pH acima de 6,7, porém menor que um quando abaixo deste valor. O hemolisado apresentou efeito "Root", sendo apenas 44% saturado a pH 6,4 em presença de 1mM de ATP e equilibrado com ar a uma atmosfera. Em 30°C e pH 7,6 o sangue total processa-se abaixo de p1/2, 4,7 mm de Hg, menor que o de maioria dos outros teleósteos amazônicos. Ambas as velocidades de combinação do monóxido de carbono e velocidade de dissociação do oxigênio são dependentes do pH e ATP. Entre pH 6,2 e 8,8 a velocidade do COon aumenta 10 vezes. ATP reduz a velocidade em valores de pH Intermediários. A velocidade de Ooff aumenta 2,4 vezes entre pH 8,8 e 6,7. A adição de 1 mM de ATP produz um aumento de 4,5 vezes sobre a mesma faixa de pH. Os baixos valores de n abaixo de pH 6,7 e a heterogeneidade da combinação de CO e o processo de dissociação da combinação de O2 sugerem que os componentes da hemoglobina podem ser funcionalmente diferenciados e/ou existem diferenças intramolecular nas propriedades cinéticas das cadelas oc e β.

Summary The hemoglobin system ot the jaraqui, Prochilodus sp., consists of multiple hemoglobin components. The oxidized derivative elutes as a single molecular weight species in gel filtration experiments. The carboxy derivative has an apparent molecular weight of 60,000 as determined by gel filtration. A 44-fold change In p1/2 occurs between ph 6.4 and 8 6 in stripped hemoglobin solutions. This change increases to 388-fold over the same pH range in the presence of 1mM ATP, Cooperativity in oxygen binding, as measured by n in the Hill equation, is greater than one at pH values above 6.7 but less than one below this value. The hemolysate displays a Root effect, being only 44% saturated at pH 6.4 in the presence of 1 mM ATP and equilibrated with air at one atmosphere. At 30°C and pH 7.6 the whole blood possesses a low p 4.7 mm Hg lower than that of many other Amazonian teleosts. Both the carbon monoxide combination rate and the oxygen dissociation rate are pH and ATP dependent. Between pH 6.2 and 8.8 the COon rate increases 10-fold. ATP reduces the rate at intermediate pH values. The O2off rate increases 2.4-fold between pH 8.8 and 6.7. Addition of 1 mM ATP causes a 4.5-fold Increase over the same pH range. The low n values below pH 6.7 and the heterogeneity of the CO combination and O3 dissociation processes suggests that the hemoglobin components may be functionally differentiated and/or intra-molecular differences exist in the kinetic properties of oc and β like chains.