Grapevine leafroll-associated virus 3 (GLRaV-3), a principal espécie viral do complexo do enrolamento da folha da videira (Vitis spp.), causa reduções no rendimento e na qualidade da uva. O gene da proteína capsidial foi amplificado via RT-PCR a partir de RNA total, extraído de folhas de videira infectadas. O fragmento amplificado foi clonado e completamente seqüenciado. Em seguida, o fragmento foi subclonado no vetor de expressão pRSET-C. O plasmídeo recombinante foi utilizado para a expressão da proteína capsidial em Escherichia coli BL21:DE3. A proteína capsidial, ligada a uma cauda de 6-His, foi purificada por cromatografia de afinidade em coluna de Ni-NTA. A identidade da proteína purificada foi confirmada em SDS-PAGE e Western blot e, após quantificação, foi utilizada para imunizar coelhos. O anti-soro mostrou-se sensível e específico para a detecção do GLRaV-3 em extratos de videira por Western blot e DAS-ELISA, não tendo sido observadas reações inespecíficas ou heterólogas contra outros vírus sorologicamente não relacionados.

Grapevine leafroll-associated virus 3 (GLRaV-3), the main viral species of the grapevine leafroll complex, causes yield and quality reduction in grapes (Vitis spp.). The coat protein gene was RT-PCR-amplified from total RNA extracted from infected grapevine leaves and the amplified fragment was cloned and completely sequenced. The fragment was subsequently subcloned into the pRSET-C expression vector. The recombinant plasmid was used to transform Escherichia coli BL21:DE3 and express the capsid protein. The coat protein, fused to a 6 His-tag, was purified by affinity chromatography using an Ni-NTA resin. The identity of the purified protein was confirmed by SDS-PAGE and Western blot. The in vitro-expressed protein was quantified and used for rabbit immunizations. The antiserum was shown to be sensitive and specific for the detection of GLRaV-3 in grapevine extracts in Western blot and DAS-ELISA assays, with no unspecific or heterologous reactions against other non-serologically related viruses being observed.

As principais espécies de vírus envolvidas na etiologia do enrolamento da folha da videira (Vitis spp.) são Grapevine leafroll-associated virus 1 e 3 (GLRaV-1 e -3). Neste estudo da variabilidade desses vírus, foram amplificados dois fragmentos de DNA (396 bp do GLRaV-1 e 602 bp do GLRaV-3) por RT-PCR, a partir de RNA total extraído de nervuras e pecíolos de videiras infetadas, utilizando-se dois pares de oligonucleotídeos. Os DNAs amplificados foram clonados e reamplificados, a partir dos clones recombinantes, e comparados quanto às diferenças conformacionais das fitas simples desnaturadas (SSCP). Foram observados dois padrões distintos de perfis eletroforéticos para cada vírus, tendo sido seqüenciado pelo menos um clone viral correspondente a cada padrão. As duas seqüências de nucleotídeos obtidas para o GLRaV-1 apresentaram maior homologia (79,8% e 87,4%) com um isolado australiano e as duas seqüências relativas ao GLRaV-3 exibiram maior homologia (75,1% e 81,8%) com um isolado norte-americano. Os resultados demonstraram a ocorrência de seqüências variantes destes vírus nas videiras analisadas.

The main viral species associated with grapevine (Vitis spp.) leafroll etiology are Grapevine leafroll-associated virus 1 and 3 (GLRaV-1 and -3). To partially evaluate the variability of these viruses, two DNA fragments (396 bp of GLRaV-1 and 602 bp of GLRaV-3) were amplified by RT-PCR using two sets of primers after total RNA extraction from veins and petioles of infected grapevines. The amplified DNA fragments were cloned and the reamplified viral DNAs, obtained from the recombinant clones, were studied with regard to denatured single-strand DNA conformational differences. Two different electrophoretic profiles were observed for each virus species. At least one viral clone representing each mobility profile was sequenced. The two nucleotide sequences obtained for GLRaV-1 showed the highest homologies (79,8% and 87,4%) with an Australian isolate, whereas the two nucleotide sequences of GLRaV-3 exhibited the highest homologies (75,1% and 81,8%) with a North American isolate. These results demonstrated the occurrence of GLRaV-1 and -3 sequence variants infecting the analysed grapevines.

Rupestris stem pitting associated virus (RSPaV) é o agente causal das "caneluras do tronco de Rupestris" da videira (Vitis spp.). Neste trabalho, um isolado de RSPaV, encontrado em videiras cv. Cabernet Franc no Rio Grande do Sul, foi estudado. O vírus foi detectado biologicamente, por enxertia em videira indicadora cv. Rupestris du Lot, em 26,2% das amostras avaliadas. A seqüência parcial do gene da replicase do RSPaV, isolado sul-brasileiro, com 831 nucleotídeos amplificados por RT-PCR e 276 aminoácidos deduzidos, apresentou maior identidade de nucleotídeos (98,1%) e aminoácidos deduzidos (99,6%), com dois isolados norte-americanos. O RSPaV estudado apresentou baixa homologia (37-41%) com outros vírus do gênero Foveavirus. A maioria das mudas de videira cv. C. Franc infetadas com RSPaV apresentou diminuição no potencial fotossintético (2,68 a 5,12 vezes) e aumento na taxa respiratória no escuro quando comparadas a mudas sadias, salientando os impactos que esse vírus pode proporcionar no potencial produtivo de videiras.

The Rupestris stem-pitting associated virus (RSPaV) is reported to cause stem pitting disease in grapevines (Vitis spp.). This work studies an RSPaV-isolate found infecting grapevine cv. C. Franc in the State of Rio Grande do Sul, Brazil. This isolate was detected biologically, by grafting on Rupestris du Lot grapevine indicator, in 26.2% of the analysed samples. The partial replicase gene sequence of the Southern Brazilian RSPaV isolate, with 831 nucleotides amplified by RT-PCR and 276 deduced amino acids, showed high identities of nucleotides (98.1%) and deduced amino acids (99.6%), with two RSPaV North American isolates. The RSPaV studied showed low homology (37-41%) with other members of the genus Foveavirus. Most of the virus-free rootstocks grafted with RSPaV infected scions showed photosynthetic potential reduction (2.68 to 5.12 times) and dark respiratory rate increase when compared to healthy ones, emphasizing the potential negative impact of this virus on grapevine production.

O Grapevine virus A (GVA) está associado à "Acanaladura do lenho de Kober", uma doença do complexo rugoso da videira (Vitis spp.). Neste trabalho, um isolado brasileiro de GVA (GVA-RS) foi caracterizado biologicamente por transmissão mecânica para cinco hospedeiras herbáceas e por enxertia na videira indicadora cv. Kober 5BB, e também por sorologia. O RNA total foi extraído de videira infetada cv. Pirovano 65. Para a RT-PCR, dois pares de oligonucleotídeos foram utilizados. Dois fragmentos de DNA, 430 e 451 pb, apresentando sobreposição parcial de nucleotídeos, foram amplificados por PCR. A seqüência do gene da proteína capsidial do GVA-RS com 597 nucleotídeos e 198 aminoácidos deduzidos, com massa molecular calculada de 21,6 kDa, foi alinhada a outros isolados virais. As seqüências de nucleotídeos e aminoácidos deduzidos do GVA-RS apresentaram maior identidade, 91,4% e 95,4%, respectivamente, com um isolado italiano. O GVA-RS apresentou expressiva divergência dos Vitivirus Heracleum latent virus (HLV), Grapevine virus B (GVB) e Grapevine virus D (GVD), com identidade de nucleotídeos variando de 76% a 83,1%.

The Grapevine virus A (GVA) is associated with the Kober stem grooving disease, which is part of the grapevine (Vitis spp.) rugose wood complex. In this work, a Brazilian isolate of GVA (GVA-RS) was characterized biologically by mechanical transmission to five herbaceous hosts, by grafting on Kober 5BB grapevine indicator and by serology. Total RNA was extracted from infected grapevine cv Pirovano 65. For a reverse transcribed polymerase chain reaction, two sets of primers were used, resulting in two partially overlapping DNA fragments of 430 and 451 base pairs. The coat protein gene sequence of GVA-RS with 597 nucleotides and 198 deduced amino acids with a predicted Mr of 21.6 kDa, was aligned with those of other viral isolates. The nucleotide and the amino acid sequences of GVA-RS were closest in identity to an Italian isolate, 91.4% and 95.4%, respectively. The GVA-RS exhibited a strong divergence to the vitiviruses Vitivirus Heracleum latent virus (HLV), Grapevine virus B (GVB) and Grapevine virus D (GVD), displaying nucleotide identity of 76% - 83.1%.

Um isolado de Grapevine virus B (GVB), obtido por indexação de Vitis labrusca e V. vinifera na indicadora LN33, foi transmitido mecanicamente para várias espécies do gênero Nicotiana. O vírus foi parcialmente purificado de N. cavicola e a proteína capsídica foi estimada em 23 kDa por SDS-PAGE. Ao microscópio eletrônico, observou-se, em extrato foliar de N. occidentalis e N. cavicola, partículas flexuosas com estriações transversais, predominantemente medindo 750-770 x 12 nm, com comprimento modal de 760 nm. A decoração das partículas indicou reação clara e positiva com anti-soro contra GVB. Em DAS-ELISA, GVB foi detectado em extratos de Nicotiana spp. e de videira (Vitis spp.). Em Western blots foram observadas reações específicas e cruzadas, da proteína capsídica de GVB com os anti-soros contra GVB e GVA, respectivamente. A partir do RNA viral extraído de N. occidentalis, foi amplificado por RT-PCR um fragmento de 594 bp específico de GVB, que codificou 197 aminoácidos do gene da proteína capsídica. As seqüências de nucleotídeos e de aminoácidos deduzidos do gene da proteína capsidial apresentaram alta identidade com isolados italianos e japoneses de GVB.

An isolate of Grapevine virus B (GVB), obtained by indexing Vitis labrusca and V. vinifera grapevines on the indicator LN33, was transmitted mechanically to several Nicotiana species. The virus was partially purified from N. cavicola and the coat protein estimated at 23 kDa by SDS-PAGE. In negatively stained leaf extracts of experimentally inoculated N. cavicola and N. occidentalis, flexuous particles with cross banding were observed, predominantly measuring 750-770 x 12 nm, with a modal length of 760 nm. Decoration indicated a clear, positive reaction against AS-GVB. In DAS-ELISA, GVB was detected in N. cavicola and grapevine extracts, and Western blots showed homologous and cross reaction of GVB and GVA antisera with GVB coat protein. Using specific primers for GVB, a fragment of 594 bp, comprising the coat protein gene coding for 197 amino acids, was amplified by RT-PCR with viral RNA extracted from GVB-infected N. occidentalis. The nucleotide and the deduced amino acid sequences of the coat protein gene showed high identities with Italian and Japanese isolates of GVB.

O enrolamento da folha da videira (Vitis spp.) é uma doença causada por até oito vírus, Grapevine leafroll-associated virus (GLRaV) 1 a 8, sorologicamente distintos e associados ao floema de videiras infetadas. Neste trabalho, foram detectados GLRaV-1 e -3 por DAS-ELISA em 6,9 e 14,7% das amostras analisadas, respectivamente, e provenientes de duas importantes regiões vitícolas do Brasil (Serra Gaúcha e Vale do São Francisco). Os GLRaV-2, -5 e -7 não foram detectados. O GLRaV-3 também foi detectado por dot-ELISA e western blot, observando-se a provável proteína capsidial com cerca de 36 kDa. Um fragmento de 340 pb, compreendendo o terminal 3' do gene da polimerase viral de GLRaV-3, foi amplificado por PCR e seqüenciado. As seqüências de nucleotídeos e aminoácidos deduzidos deste isolado apresentaram alta homologia, 95,0 e 97,1%, respectivamente, com outro isolado de GLRaV-3 (NY1).

Grapevine (Vitis spp.) leafroll is a disease caused by up to eight viruses, denominated Grapevine leafroll-associated viruses (GLRaV- 1 to -8), which are serologically unrelated and associated with phloem tissue. In the present paper, GLRaV-1 and -3 were detected by DAS-ELISA in 6.9 and 14.7% of the samples, respectively, and GLRaV-2, -5 and -7 were not detected in grapes. The analysed samples came from two of the most important grape growing regions in Brazil (Serra Gaúcha and Vale do São Francisco). The GLRaV-3 was also identified by dot-ELISA and western blot, associated with a probable coat protein subunit of approximately 36 kDa. A fragment of 340 bp, comprising the 3' terminal of the viral polymerase gene, was PCR-amplified and sequenced. The nucleotide and deduced amino acid sequences of this isolate showed high homology, 95 and 97.1%, respectively, with another GLRaV-3 isolate (NY1).

Apple stem grooving virus (ASGV) é um dos mais importantes vírus que infetam fruteiras de clima temperado. Este estudo teve por objetivo a caracterização molecular baseada na análise do gene da proteína capsidial do isolado ASGV UV01 encontrado em macieiras (Malus domestica) em Santa Catarina (SC). RNA extraído de plantas infetadas foi usado para a amplificação por RT-PCR, empregando-se iniciadores específicos. O fragmento amplificado de 755 bp foi seqüenciado e comparado com outras seqüências. O gene da proteína capsidial do ASGV UV01 possui 714 nucleotídeos, codificando uma proteína com 237 aminoácidos de Mr prevista de 27 kDa. As seqüências de nucleotídeos e de aminoácidos deduzidos apresentaram, respectivamente, 90,9% e 97,9% de identidade com um isolado japonês de ASGV. Homologias de aminoácidos muito altas (98,7%) também foram verificadas com o Citrus tatter leaf virus (CTLV), um vírus taxonomicamente próximo ao ASGV. Os resultados indicam pequena variabilidade entre isolados de Capillovirus de diferentes regiões. Em um levantamento restrito, plantas adultas usadas como matrizes e mudas introduzidas no país para produção de frutos foram indexadas e mostraram-se infetadas com ASGV (20%), geralmente em complexo com outros vírus (latentes) da macieira (80%).

Apple stem grooving virus (ASGV) is one of the most important viruses infecting fruit trees. This study aimed at the molecular characterization of ASGV infecting apple (Malus domestica) plants in Santa Catarina (SC). RNA extracted from plants infected with isolate UV01 was used as a template for RT-PCR using specific primers. An amplified DNA fragment of 755 bp was sequenced. The coat protein gene of ASGV isolate UV01 contains 714 nucleotides, coding for a protein of 237 amino acids with a predicted Mr of approximately 27 kDa. The nucleotide and the deduced amino acid sequences of the coat protein gene showed identities of 90.9% and 97.9%, respectively, with a Japanese isolate of ASGV. Very high amino acid homologies (98.7%) were also found with Citrus tatter leaf capillovirus (CTLV), a very close relative of ASGV. These results indicate low coat protein gene variability among Capillovirus isolates from distinct regions. In a restricted survey, mother stocks in orchards and plants introduced into the country for large scale fruit production were indexed and shown to be infected by ASGV (20%), usually in a complex with other (latent) apple viruses (80%).